| 研究課題/領域番号 |
17K08531
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
藤井 拓人 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 助教 (50567980)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | カチオン輸送ポンプ / ATP13A2 / パーキンソン病 / リソソーム / 神経細胞 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、神経細胞のリソソームに発現するパーキンソン病の病因遺伝子の一つとして同定されたATP13A2のイオン輸送機構の全容、およびATP13A2のイオン輸送機能異常が関与する新規のパーキンソン病発症メカニズムを明らかにすることを目的としている。昨年度の研究から、ATP13A2の酵素活性が反応溶液中のK+濃度に依存性することから、K+がATP13A2の輸送イオン種の候補である可能性が示唆された。また、パーキンソン病患者において報告されている各種点変異体において、A746T、R449Q変異体では発現レベルが、G533R、R980H変異体では酵素活性がそれぞれ減少することを見出した。本年度はまず、K+のカウンターカチオンの探索を行った。反応溶液中にK+に加えてNa+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Al3+などをそれぞれ加えて酵素活性を測定したが、いずれもさらなる活性上昇は観察されなかった。従って、従来のP型ATPaseの輸送基質や酵母のATP13A2ホモログが輸送すると推測されているMn2+やZn2+は、ATP13A2の輸送基質では無い可能性が示唆された。また、ATP13A2と機能を調節する分子として、ATP13A2と同じP型ATPaseに属し、小胞体に発現しているオーファンカチオンポンプER-ATPase（仮称）を見出した。興味深いことにER-ATPaseを ATP13A2と共発現させることで、ATP13A2の酵素活性は著しく低下した。また、ER-ATPase単独発現細胞を用いた解析において、ER-ATPaseの酵素活性は、反応溶液中のNa+とK+濃度に依存することが示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年度までの研究により、K+がATP13A2の輸送イオン種の候補であること、ATP13A2のloss of functionがパーキンソン病に関連している可能性を見出した。また本年度の研究において、ATP13A2の活性を負に制御する分子としてER-ATPaseを見出した。マウスおよびヒトER-ATPaseの遺伝子クローニングおよびER-ATPaseの発現系は構築を完了している。現在、各種抗体を用いたATP13A2とER-ATPaseとの免疫沈降実験を行い両者の分子会合の可能性についての検討を進めている。また、ER-ATPaseのNa+およびK+輸送に関与すると推定されるアミノ酸残基の変異体を作製し、ER-ATPaseの詳細な機能解析についても行っている。さらに、今後の実験計画として予定している単離リソソームを用いたイオン輸送解析にむけて、ATP13A2発現細胞からインタクトなリソソームを高純度で精製する方法を検討中である。以上の点から、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
1) ATP13A2発現細胞より精製したリソソームサンプル、ATP13A2を再構成したリポソームにおいてK+の放射性同位体である86Rb+を用いたトレーサー実験等を行うことで、リソソーム膜を介したATP13A2のイオン輸送機能の詳細を明らかにする。2) パーキンソン病モデルマウスから単離した初代培養神経細胞やリソソームを用いてATP13A2の病態生理機能の解析を行う。3) パーキンソン病モデルマウスにおけるER-ATPaseの発現レベルおよび機能を解析することで、パーキンソン病の発症と両者の機能的関連性の関連性について検討する。4) ATP13A2の機能調節に関与するER-ATPase以外の分子を探索する。5) これまでに構築した発現系、機能評価系を用いて、ATP13A2およびER-ATPaseの機能もしくは発現レベルを変化させることで、パーキンソン病モデルマウスの神経変性症状を緩和させる化合物を探索する。以上の研究成果を総括し、新しいパーキンソン病治療法開発の研究基盤につなげる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度は42円が余ったが、これは研究計画の変更等が原因ではなく、42円以下の物品を請求しなかったためである。
次年度に物品請求費として利用する予定である。
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