疾患原因遺伝子変異から探る細胞膜興奮性制御の統合的生理機構の解明

2020 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K08534
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 秋田 天平 浜松医科大学, 医学部, 准教授 (00522202)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2022-03-31
• キーワード: 発達性てんかん性脳症 / 液胞型プロトンポンプ / CRISPR-Cas9 / シナプス小胞 / 胎生期 / 大脳皮質 / 電位依存性イオンチャネル / タウリン

研究実績の概要

本年度の主な実績として、発達性てんかん性脳症患者で新たに見出された、液胞型プロトンポンプV-ATPase変異体の機能解析を行い、出版に至った（2021年4月8日）ことが挙げられる。V-ATPaseは様々な細胞内小器官の膜に発現し、小器官内の酸性化を担う。変異は脳に豊富に発現するサブユニットATP6V0A1で見つかり、ポンプ機能を低下させることが判明した。本研究では今年度ノーベル化学賞受賞対象となったCRISPR-Cas9ゲノム編集技術を用いて、患者と同じ変異を導入した遺伝子改変マウスを作成し解析を行ったことに新規性があり、本研究者はそれを用いて変異の脳内神経シナプス伝達への影響を解析したところ、シナプス小胞内の伝達物質量が、興奮性のグルタミン酸及び抑制性のGABAともに減少し、またシナプス総数も低下していることを明らかにした。これらは、変異によりシナプス小胞内の酸性化が弱まり伝達物質の充填が悪くなったことと、細胞内の老廃物を処理する小器官の機能不全で神経変性が促されたことによることが、他のデータからも示唆された。今後このマウスを用いた研究により、効果的な治療法の開発が進むことが期待される。
また、遺伝子変異の神経発達段階への影響、及びその後の細胞膜興奮性制御機構への影響を理解するための基礎研究の実績として、①大脳皮質抑制性介在神経の胎生期前駆細胞における、細胞膜興奮性を制御する2種類の新規膜電流成分について、1つは電位依存性カリウムチャネルの1種、もう1つは電位依存性を持つ新規の非選択的陽イオンチャネルに絞り込まれたこと、②胎生期大脳皮質に豊富に存在し、GABA受容体に作用するタウリンを、タウリントランスポーター遺伝子Slc6a6欠失により胎生期から枯渇させると、生後の大脳皮質錐体神経の発火応答が鈍麻することを新たに見出し、それぞれ学会発表を行った。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

上記V-ATPase変異体の機能解析を優先させる必要があったことから、これまでの継続検討課題である、KCNB1変異による発達性てんかん性脳症発症機序解明のための解析が遅れている。しかし、優先課題については幸い高インパクト誌（Nature Communications）に出版の運びとなり、また神経発達段階の基礎研究についても学会発表にこぎつけられていることから、全体としておおむね順調に進展しているといえる。

今後の研究の推進方策

患者と同じKCNB1変異を導入したマウスの大脳皮質錐体神経で確認された、興奮性刺激入力中の活動電位発火頻度の低下と発火間欠期の細胞膜電位の上昇について、特に発火時の細胞内への塩素イオン及びカルシウムイオン流入への影響を明らかにすることが、発症機序解明の足掛かりとなることが予想されている。今年度は競合する他の研究グループから、別の患者由来のKCNB1変異を導入したマウスを用いた機能解析の報告が出版されたが（Hawkins et al., Neurobiol Dis 147:105141, 2021）、変異の発火活動への影響は調べられておらず、発症機序に迫ったものではないため、我々は上記視点から、その細胞・組織・個体レベルでの検討を急ぎ、さらに今後上記イオン流入路を治療標的とした創薬の開発も念頭に、研究を推進する。
また、変異の神経発達段階への影響を理解するための基礎研究として、胎生脳抑制性介在神経前駆細胞での膜電流成分を担う新規非選択的陽イオンチャネル分子種の同定、それを含む各イオンチャネルの神経発達における役割の解明、そしてそれぞれのチャネル活性を変化させうる因子の同定等についても、引き続き更に検討を進める。

次年度使用額が生じた理由

今年度はコロナウイルス感染拡大の影響で、下記学会発表のうち3学会はWeb開催となり、旅費が節約できたため、その分を進展の遅れているKCNB1変異の解析に充てることで、研究費を有効活用する。

研究成果

• [雑誌論文] ATP6V0A1 encoding the a1-subunit of the V0 domain of vacuolar H+-ATPases is essential for brain development in humans and mice (2021)
  • 著者名/発表者名: Aoto K, Kato M, Akita T, Nakashima M, Mutoh H, Akasaka N, Tohyama J, Nomura Y, Hoshino K, Ago Y, Tanaka R, Epstein O, Ben-Haim R, Heyman E, Miyazaki T, Belal H, Takabayashi S, Ohba C, Takata A, Mizuguchi T, Miyatake S, Miyake N, Fukuda A, Matsumoto N, Saitsu H
  • 雑誌名: Nature Communications 巻: 12 ページ: 2107
  • DOI: 10.1038/s41467-021-22389-5
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] タウリントランスポーター（TauT）欠損の大脳皮質Ⅱ／Ⅲ層錐体神経発火活動への影響について (2020)
  • 著者名/発表者名: 秋田天平、細井泰志、伊藤崇志、福田敦夫
  • 雑誌名: タウリンリサーチ 巻: 6(1) ページ: 18-19
  • 査読あり
• [雑誌論文] 細胞内タウリンのプロテインキナーゼCによるリン酸化を介したGABAA受容体膜発現制御 (2020)
  • 著者名/発表者名: 渡部美穂、細井泰志、秋田天平、伊藤崇志、福田敦夫
  • 雑誌名: タウリンリサーチ 巻: 6(1) ページ: 20-22
  • 査読あり
• [学会発表] Voltage-sensitive Na+ and K+ current components in interneuron precursors in the medial ganglionic eminence of the embryonic cerebrum. (2021)
  • 著者名/発表者名: Akita T, Fukuda A
  • 学会等名: 第98回日本生理学会大会
• [学会発表] 胎児期・生後発達期のタウリン枯渇は大脳皮質錐体神経の発火応答を鈍麻させる (2021)
  • 著者名/発表者名: 秋田天平、細井泰志、渡部美穂、伊藤崇志、宮嶋裕明、福田敦夫
  • 学会等名: 第7回国際タウリン研究会日本部会学術集会
• [学会発表] 神経細胞内タウリンによるリン酸化を介したGABAA受容体発現制御機構 (2021)
  • 著者名/発表者名: 渡部美穂、細井泰志、秋田天平、伊藤崇志、福田敦夫
  • 学会等名: 第7回国際タウリン研究会日本部会学術集会
• [学会発表] 神経連続発火活動低下を伴うてんかん性脳症発症機序の解明を目指して (2020)
  • 著者名/発表者名: 秋田天平、青戸一司、才津浩智、北野勝則、福田敦夫
  • 学会等名: 第47回日本脳科学会
• [学会発表] 胎生脳内側基底核原基の神経前駆細胞における２種類の電位依存性陽イオン電流の発見 (2020)
  • 著者名/発表者名: 秋田天平、福田敦夫
  • 学会等名: 第67回中部日本生理学会
• [備考] リソソームの膜タンパク質ATP6V0A1の異常が発達性およびてんかん性脳症の原因となることを発見
  • URL: https://www.hama-med.ac.jp/public-relations/press/index.html