| 研究課題/領域番号 |
17K08549
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| 研究機関 | 東京医科大学 |
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研究代表者 |
井上 華 東京医科大学, 医学部, 講師 (20390700)
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| 研究分担者 |
村山 尚 順天堂大学, 医学部, 准教授 (10230012)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | TRPM7 / 平面膜 / チャネル |
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| 研究実績の概要 |
H29年度、セットアップを完了したcontact bubble bilayer（CBB)法を用い、SBPタグを付加したmurine TRPM7 のチャネル電流の測定を行った。H29年度に使用可否を検討したHalo-tag同様、SBPタグTRPM7は、通常の発現系（哺乳類細胞での過剰発現）では、タグを付加していないTRPM7チャネルと同等のチャネル活性を持つことを確認した。TRPM7電流の記録には、SBPタグTRPM7過剰発現細胞からSBPタグTRPM7をストレプタクチンカラムで精製して用いるが、溶出液中に含まれる界面活性剤（膜タンパク質の可溶化を目的として使用）は、CBBの維持を阻害する。そのため、界面活性剤の除去法を検討し選定した。また、人工膜の脂質組成の検討を行った。安価で汎用のasolectin、高価な合成品のホスファチジルコリン（PC)、ホスファチジルエタノールアミン（PE)、ホスファチジルセリン（PS)の混合脂質（PC:PE、PC:PSなど）を試した結果、asolectinは精製ロットによって夾雑物が存在して記録を妨害することが判明した。PC:PE膜では200mVの電圧負荷でも長時間（～30分）の記録に耐えうることが分かった。PC:PE膜を用いたCBB法でのTRPM7チャネル電流の安定的測定を実現することに成功し、二価陽イオンの非存在下で①シングルチャネルコンダクタンス36～53pSであり、これまでにTRPM7シングルチャネルで報告されている値と同等であること、②開確率0.75が記録時間中維持されることを明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
チャネルタンパクの精製方法、および脂質膜組成、チャネルリポソームの調整方法など、安定記録のための条件を確立し、長時間記録に成功した。
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| 今後の研究の推進方策 |
CBBに埋め込んだチャネルの配向を見極めたり、薬物の影響を検討するには、bouble内を還流するシステムを備える必要がある。H30年度の終盤にbouble内に薬液を投与するためpicopump(PV820)を設置したが、排出圧の調節が難しく、記録中の還流はまだ成功していない。平成31年度（令和元年度）は初めにbouble内還流を確実にできるような方法を検討し、様々な薬物、酸化ストレスのTRPM7チャネルへの影響を明らかにする。また、TRPM7チャネルドメインのみの変異体とリコンビナントTRPM7キナーゼドメインの相互作用について検討し、細胞を用いたパッチクランプ実験の結果と比較検討する。人工膜上でのTRPM7活性と、細胞に発現するTRPM7活性を比較することで、細胞内に存在する様々な分子のTRPM7活性への影響を見積もる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Bubble内還流用の機器を、廃棄処分となっている機器を譲り受けて使用したため、支出減となった。H31年度は主に試薬類に支出する予定である。
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