| 研究課題/領域番号 |
17K08553
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| 研究機関 | 久留米大学 |
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研究代表者 |
武谷 三恵 久留米大学, 医学部, 助教 (30289433)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 精嚢 / 自動能 / 粘膜 / 上皮基底細胞 / 間質細胞 / 平滑筋 / 細胞内カルシウムストア / カルシウム活性化クロライドチャネル |
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| 研究実績の概要 |
精嚢の自発収縮発生機構を検討するため、モルモット精嚢から機械的剥離により作製した粘膜標本を用いて蛍光Ca2+イメージング、細胞内電位記録、蛍光免疫染色を行い、粘膜組織内で自発活動を発生する細胞を探索した。その結果、粘膜の基底面(筋層との境界側)に自発Ca2+活動を発生する2種類の細胞群が観察された。
1つは、上皮層内で不規則な自発細胞内Ca2+濃度上昇を非同期性に発生するサイトケラチン陽性の基底細胞群であり、小胞体からの自発Ca2+放出がCa2+活性化Cl-チャネル(CaCC)を開口させてCl-の細胞外流出による脱分極を発生していると考えられた。
また、上皮下には、規則的な自発Ca2+濃度上昇を同期性に発生する大型のビメンチン陽性間質細胞群が分布していた。これらの同期性活動も、小胞体のCa2+放出・取込み機構およびCl-透過性に依存していた。筋活動との関連を調べるために、上皮層の部分切除により上皮下間質細胞層を露出させた筋標本を観察したところ、上皮下間質細胞群の同期性Ca2+濃度上昇の直後に平滑筋細胞群のCa2+濃度上昇と収縮が発生していたことから、上皮下間質細胞の同期性Ca2+活動が筋活動を誘発していることが示唆された。
免疫染色ではc-Kit受容体陽性間質細胞を含め、既知の平滑筋臓器ペースメーカーは検出されなかった。上皮下間質細胞の一部は血小板成長因子受容体(PDGFR)α陽性だった。
近年我々は、精嚢平滑筋は粘膜を有する時のみ、CaCCの開口を伴う小胞体Ca2+の放出に依存して膜電位振動を発生し、これが筋のL型Ca2+チャネルの開口・収縮のトリガーとなることを報告している。今回、基底細胞、上皮下間質細胞のどちらの活動もCl-透過性および小胞体由来のCa2+に依存していたことから、基底細胞の自発活動が起源となり上皮下間質細胞の同期性活動を誘発している可能性も示唆された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本年度の課題であった精嚢粘膜内で自発活動を発生する細胞を、上皮基底細胞と上皮下に分布する間質細胞に見出すことができた。特に、平滑筋活動が上皮下間質細胞の同期性自発活動に続いて発生する現象も確認できたことから、少なくとも上皮下間質細胞の自発活動は精嚢平滑筋の自動能発現に寄与していることが示唆される。
また、予備実験において、P2Y受容体（ATPの代謝型受容体）作動薬であるADP（アデノシン二リン酸）は、①直接筋の興奮を誘発せずに粘膜依存性の筋活動を増強する、②基底細胞および上皮下間質細胞にCa2+応答を誘発する、という結果を得ており、今後、粘膜におけるATPの放出、分解、シグナル応答に関与する分子の同定や分布の検討は、粘膜組織内における自発活動発生機構を解明する有用な手がかりになると思われる。
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| 今後の研究の推進方策 |
同期性の自発Ca2+活動を発生する上皮下間質細胞について、①自発活動の発生機構、②細胞マーカーの探索、③平滑筋へのシグナル伝達機構を明らかにすることを目標とする（各項目の詳細は以下のとおり）。
①自発活動発生機構については、上皮下間質細胞自身が自動能の起源であるのか、あるいは液性因子や他種細胞からのギャップ結合を介した電気シグナル等により同期性Ca2+活動が誘発されるのか、精嚢組織標本や単離細胞を用いて検討する。機能的マーカーとして、Ca2+活性化Cl-チャネルとして知られるTMEM16AやTMEM16B、またP2Yを介したシグナル伝達機構に関与する分子、さらに機械感受性チャネルとして知られるTRPチャネルやPiezoチャネル等の機能的発現についても調べる。
②同期性の自発Ca2+活動を有する上皮下間質細胞におけるPDGFRα発現を検討する。消化管や膀胱に分布するPDGFRα陽性間質細胞は、自発的およびP2Y1受容体刺激により、細胞内Ca2+濃度上昇を発生し、Ca2+活性化K+チャネル開口による過分極（興奮を抑制する）応答を起こすことが報告されている。精嚢で筋の興奮を誘発するのはPDGFRα陽性間質細胞か、またはPDGFRαもc-Kit受容体も発現していない第三の間質細胞か、いずれにしても他の平滑筋臓器でペースメーカーとして同定されていない細胞であることが示唆され、その特徴を明らかにする。
③上皮下間質細胞の同期性活動はギャップ結合を介して筋へ伝播するのか、薬理学的検討、細胞内染色による色素の拡散、コネキシンの分布などの組織学的検討を行う。また、一度剥離した粘膜を筋層に近接して設置した時に自発収縮が回復するか観察し、筋への伝達様式が液性因子によるものか、検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
理由：研究開始当初は、従来から使用していた蛍光Ca2+指示薬『Cal520AM』で観察したところ、上皮基底細胞の自発Ca2+活動のみが検出され、これに対する小胞体Ca2+ポンプ阻害薬やATP受容体作動薬などの効果を検討していた。しかし、S/N比を改良した後継品『Calbryte520AM』にCa2+指示薬を変更したところ、上皮下間質細胞の同期性Ca2+活動が存在することが明らかとなった。上皮下間質細胞の同期性活動の観察に適切なCalbryte520AMの負荷条件を検討した後、上皮基底細胞で実施したように同期性Ca2+活動に対する薬理作用を観察することに時間を費やしたため、当初計画していたほど多種類の試薬や抗体を購入使用するには至らなかった。
使用計画：上皮下間質細胞の自発活動発生機構と細胞マーカーを明らかにするために実験動物、試薬、抗体を購入する。また、得られた成果を学会や論文として発表する予定である。
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