代謝型プリン受容体P2Y1Rの膜電位依存性の構造基盤および構造変化の解明

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K08557
• 研究機関: 生理学研究所
• 研究代表者: 立山 充博 生理学研究所, 分子細胞生理研究領域, 准教授 (30276472)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 膜電位依存性 / 代謝型プリン受容体P2Y1R / 膜電位固定下蛍光強度計測 / ゲーティング電流記録

研究実績の概要

本研究は、代謝型プリン受容体P2Y1Rを介するシグナル伝達効率が膜電位に依存して変化するという性質が、P2Y1R自身の膜電位依存性よるものかを検証すること、および膜電位依存性をもたらす構造基盤の解明を目的としている。これまで、膜電位依存性チャネルなどにおいて、膜電位変化によるタンパク質の微細構造変化は、荷電性アミノ酸残基の電荷移動（ゲーティング電流）や特定のアミノ酸残基に付加された蛍光物質の蛍光強度変化として検出・解析がなされている。そこで、29年度はP2Y1RをHEK293細胞に発現させ、パッチクランプ法によるP2Y1Rのゲーティング電流を記録すること、fluorescent unnatural amino acidであるAnapを特定のアミノ酸残基に導入し、その蛍光強度を膜電位固定化にて測定することを計画した。
ゲーティング電流記録については、電位依存性カリウムチャネルや電依存性フォスファターゼを用いて記録条件を確立した。しかしながら、膜電位依存性が報告されているムスカリン性受容体M2Rや本研究の対象とするP2Y1Rでは、ゲーティング電流は検出できなかった。これは、受容体での電荷移動が小さいことや膜に発現する受容体量が十分ではないことによるものと思われる。一方、HEK293細胞発現系で蛍光強度変化測定のためにAnapを膜電位依存性フォスファターゼ、蛍光タンパク質YFPやP2Y1Rの特定の部位に導入することに成功し、その機能も保持されることを確認した。しかしながら、電依存性フォスファターゼの膜電位変化による蛍光強度変化の検出には至らなかった。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

膜電位依存性を示すカリウムイオンチャネルや電位依存性フォスファターゼに関して、培養細胞発現系においてゲーティング電流として記録することに成功した。同様な実験条件下で、膜電位依存性を示すことが知られているムスカリン性受容体M2Rや本研究が対象とする受容体P2Y1Rではゲーティング電流を記録出来なかった。これは、移動する電荷量が小さいことや膜に発現するタンパク質の量が少ないためと考えられる。
膜電位変化による膜タンパク質の構造変化を膜タンパク質にラベルした蛍光色素の蛍光強度変化として捉えることが可能である。培養細胞発現系に膜電位固定化蛍光強度計測（Voltage clamp fluorometry, VCF）法を適用できれば、研究の大きなアドバンテージになると考え、培養細胞系を用いて条件検討を行った。fluorescent unnatural amino acidであるAnapを特定の部位に導入すること、蛍光強度を計測するセットアップを起ち上げることは出来たが、膜電位変化による蛍光強度変化の検出には至らなかった。これは、細胞内に取り込まれるAnapの非特異的蛍光が大きいことが原因と考えられる。
ゲーティング電流記録とVCFについて、培養細胞発現系での限界が明らかとなり、Xenopus oocyte発現系を用いた研究へと集中するよう研究方針が明確となった。

今後の研究の推進方策

本研究は、Gタンパク質共役型受容体P2Y1Rの膜電位変化による構造変化を可視化することを目的としている。ゲーティング電流記録および Voltage clamp fluorometry (VCF）法による蛍光強度変化の検出は、培養細胞発現系では非常に困難であることが明らかとなった。そこで、今後は、Xenopus oocyteに受容体を発現させ VCF法による構造変化の可視化を目指す。電位依存性イオンチャネルや膜電位依存性フォスファターゼの研究では、Xenopus oocyte発現系でのVCF法による蛍光強度変化の解析は報告されているため、P2Y1Rについても蛍光強度変化を検出できる可能性は高い。一方、ラベル化の成否や蛍光変化の有無は、ラベルする部位により大きく異なることが予想されるため、多くの部位に蛍光ラベルを試みる必要がある。そこで、イオンチャネル等を用いて、Xenopus oocyte発現系でのVCF法の条件検討を行いながら、P2Y1Rのラベル化用コンストラクトを作製し、P2Y1Rの膜電位変化による構造変化の可視化を目指したい。

次年度使用額が生じた理由

当初、Xenopus oocyte発現系を用いたゲーティング電流記録およびVoltage-clamp fluorometry（VCF）法を計画していたが、Xenopus oocyte用２電極電圧クランプワークステーションを導入するための予算が不足していたため、培養細胞発現系を用いた研究に計画を変更した。培養細胞発現系でゲーティング電流記録とVCF法の適用についての限界が明らかとなったため、30年度以降は、Xenopus oocyte発現系の実験を中心に行うよう計画している。既存の電気生理用機器を組み込み、Xenopus oocyte用２電極電圧位固定実験に必要な機材の購入を予定している。

研究成果

• [雑誌論文] Activation of AMPK-Regulated CRH Neurons in the PVH is Sufficient and Necessary to Induce Dietary Preference for Carbohydrate over Fat (2018)
  • 著者名/発表者名: Okamoto S., Sato T., Tateyama M., Kageyama H., Maejima Y., Nakata M., Hirako S., Matsuo T., Kyaw S., Shiuchi T., Toda C., Sedbazar U., Saito K., Asgar N. F., Zhang B., Yokota S., Kobayashi K., Foufelle F., Ferre P., Nakazato M., Masuzaki H., Shioda S., Yada T,. Kahn B.B., Minokoshi Y.
  • 雑誌名: Cell Reports 巻: 22 ページ: 706～721
  • DOI: 10.1016/j.celrep.2017.11.102
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ivermectin activates GIRK channels in a PIP2 -dependent, Gβγ-independent manner and an amino acid residue at the slide helix governs the activation. (2017)
  • 著者名/発表者名: Chen, I.S., Tateyama, M., Fukata, Y., Uesugi, M., & Kubo, Y.
  • 雑誌名: Journal of Physiology 巻: 595 ページ: 5895-5912
  • DOI: 10.1113/JP274871.
  • 査読あり
• [学会発表] 代謝型グルタミン酸受容体mGlu2とGq共役型モノアミン受容体の機能的相互作用 (2018)
  • 著者名/発表者名: 立山充博、久保義弘
  • 学会等名: 第95回日本生理学会大会