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本研究では超解像顕微鏡法の中でも最も高い空間分解能を有する単一分子局在化法によってシナプス前終末内でシナプス小胞の放出部位の数を規定しているMunc13-1ナノクラスターの数や形態などの時空間動態の解析を行うことを目的としている。Munc13-1ナノクラスターの単一分子局在化法による時空間動態の解析のためには、生きた神経細胞内で観察対象分子に標識した蛍光分子を高速で蛍光明滅させる技術開発が必要である。
昨年度までに蛍光消光団に対するモノクローナル抗体の一本鎖抗体からなる蛍光分子タグを開発し、細胞内で消光団との共有結合によって消光されていた蛍光プローブの蛍光を明滅させる成功している。昨年度までに行った蛍光明滅分子タグの細胞内での発現条件の最適化により蛍光明滅分子タグを培養細胞内で発現させ、生きた細胞内で惹起した蛍光明滅を用いて実際に単一分子局在化法による超解像イメージングが可能かどうかを調べた。テストとして細胞内小器官に蛍光明滅分子タグを発現させることで標的の細胞内小器官での蛍光明滅を確認した。その結果、超解像イメージを数10秒の時間分解能で得ることができた。この成果は今回開発した蛍光分子タグによる蛍光明滅が生きた細胞内で長時間にわたって可能であることを示すものである。これによって、これまで困難であった生きた培養細胞内の分子を観察対象とした単一分子局在化法による超解像イメージング法が可能になった。本技術をシナプス関連分子に適用することによってMunc13-1タンパク質を始め種々の分子のナノクラスターの超解像イメージングの実現に近付いた。
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