インスリン/IGFシグナルを修飾するIRSのモノユビキチン化の制御機構の解明

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K08625
• 研究機関: 東京工業大学
• 研究代表者: 福嶋 俊明 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 助教 (70543552)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: インスリン / インスリン様成長因子 / インスリン受容体基質 / ユビキチン / がん / 糖尿病 / Nedd4 / USP15

研究実績の概要

代謝調節/成長促進に重要なインスリン/インスリン様成長因子（IGF）の細胞内シグナルは、インスリン受容体基質（IRS）を介して伝達される。申請者らは、「IRS2がモノユビキチン化を受けるとインスリン/IGFシグナルが増強する」という現象を見出し、さらに、IRS2のモノユビキチン化の過剰な減弱/増強がインスリン/IGFシグナルの過剰な減弱/増強を引き起こし、これが糖尿病やがんの発症や進行に寄与することを示してきた。また、ユビキチンリガーゼNedd4がIRS2をモノユビキチン化する、脱ユビキチン化酵素USP15がIRS2のモノユビキチン化を除去することも明らかにしていた。本研究では、IRS2のモノユビキチン化の制御機構を解析し、IRS2のモノユビキチン化量を調節することによりインスリン/IGFシグナルを修飾する手法を開発することを目的とする。
2018年度は、栄養条件を変動させた際のNedd4の活性調節機構を明らかにするために、低栄養培地（アミノ酸除去培地）で培養した細胞におけるNedd4の分子修飾や結合タンパク質の変動をLC-MS/MSなどを用いて解析した。その結果、低栄養条件ではNedd4の自己ユビキチン化量が増加し、Nedd4のユビイチンリガーゼ活性が上昇することが示された。また、低栄養条件ではNedd4と複数のタンパク質の結合量が増加した。結合量が増加したNedd4結合タンパク質の中には、アミノ酸刺激によるmTORの活性化に関わるユビキチンリガーゼTRAF6が含まれていた。
一方、Nedd4の基質認識機構を明らかにするため、Nedd4とIRS2の部分欠損変異体を用いた結合実験を進め、結合領域を絞り込んだ。その結果、Nedd4のC2ドメインとIRS2のPHドメインおよびPTBドメインが互いの結合領域であることが明らかとなった。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

2017年度は、USP15のIGFシグナルの調節に果たす役割を明らかにすることができた。今年度は、USP15がインスリンシグナルの調節に果たす役割も、肝細胞H4IIEなどを用いて詳細に解明する予定であった。しかし、他の解析や論文投稿に多くの時間を要したため、こちらの解析を十分検討することができず、来年度以降に実施することとなった。そのため、進捗状況は「やや遅れている」と評価した。

今後の研究の推進方策

インスリン標的細胞として培養肝細胞H4IIEを用い、高栄養条件で培養することによりインスリン抵抗性を誘導した際の、USP15の脱ユビキチン化活性や発現量の変化を解析する。また、この細胞でUSP15の発現を抑制しIRS2のモノユビキチン化を増加させた時に、インスリンに応答した細胞内シグナルや糖代謝酵素の発現変化が回復し、糖放出が強く抑制されるようになるか検討する。このような解析から、USP15がインスリンシグナルの調節に果たす役割を明らかにする。
栄養条件を変動させた際のNedd4やの活性調節機構を明らかにするために、低栄養条件で結合量が増加することがわかったNedd4結合タンパク質について、過剰発現/発現抑制などを行い、Nedd4の活性に及ぼす影響を検討するなどの解析を行う。その後、明らかとしたNedd4の活性調節機構や基質認識機構の知見に基づき、Nedd4の活性化状態をモニターする系、Nedd4と基質であるIRS2との結合を簡便にモニターする系を開発する。これを用いて、Nedd4の酵素活性や基質結合を変化させる低分子化合物を探索する。また、以上と同様の解析をUSP15についても進め、USP15の酵素活性や基質結合を変化させる低分子化合物を探索する。
最終的に、これらの低分子化合物を用いて、IRS2のモノユビキチン化量を調節し、インスリン/IGFシグナルの強さを変化させることによりインスリン抵抗性を改善できるか、あるいはがん細胞の増殖を抑制できるか検討する予定である。成就すれば、全く新しい作用点で働く抗糖尿病薬・抗がん剤の開発に向けたシーズとして提案できる。

次年度使用額が生じた理由

「現在までの進捗状況」に記したように、今年度は、USP15がインスリンシグナルの調節に果たす役割を、肝細胞H4IIEなどを用いて詳細に解明する予定であった。しかし、他の解析や論文投稿に多くの時間を要したため、こちらの解析を十分検討することができず、次年度使用額が生じた。次年度使用額は、この未検討の解析を次年度に実施するために必要な試薬の購入費として使用する計画である。

備考

*と同じ内容は、東京大学農学生命科学研究科HP (http://www.a.u-tokyo.ac.jp/topics/2015/20150420-1.html)、および、広島大学HP (http://www.horpshima-u.ac.jp/news/show/id/22883)からも発信された。

研究成果

• [国際共同研究] カロリンスカ研究所(スウェーデン)
  • 国名: スウェーデン
  • 外国機関名: カロリンスカ研究所
• [国際共同研究] Lund大学(スウェーデン)
  • 国名: スウェーデン
  • 外国機関名: Lund大学
• [国際共同研究] 応用科学アッパーオーストリア大学(オーストリア)
  • 国名: オーストリア
  • 外国機関名: 応用科学アッパーオーストリア大学
• [国際共同研究] モナシュ大学(オーストラリア)
  • 国名: オーストラリア
  • 外国機関名: モナシュ大学
• [雑誌論文] RNA-seq of Isolated Chromaffin Cells Highlights the Role of Sex-Linked and Imprinted Genes in Adrenal Medulla Development. (2019)
  • 著者名/発表者名: Chan Wing Hei, Komada Masayuki, Fukushima Toshiaki, Southard-Smith E. Michelle, Anderson Colin R., Wakefield Matthew J.
  • 雑誌名: Scientific Report 巻: 9(1) ページ: 3929
  • DOI: 10.1038/s41598-019-40501-0.
  • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
• [雑誌論文] The integral function of the endocytic recycling compartment is regulated by RFFL-mediated ubiquitylation of Rab11 effectors. (2019)
  • 著者名/発表者名: Sakai Ryohei, Fukuda Ryosuke, Unida Shin, Aki Misaki, Ono Yuji, Endo Akinori, Kusumi Satoshi, Koga Daisuke, Fukushima Toshiaki, Komada Masayuki, Okiyoneda Tsukasa
  • 雑誌名: Journal of Cell Science 巻: 132(3) ページ: 228007
  • DOI: 10.1242/jcs.228007.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Ubiquitin-specific protease 8 deubiquitinates Sec31A and decreases large COPII carriers and collagen IV secretion. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kawaguchi Kohei, Endo Akinori, Fukushima Toshiaki, Madoka Yuka, Tanaka Toshiaki, Komada Masayuki
  • 雑誌名: Biochemical and Biophysical Research Communications 巻: 499(3) ページ: 635-641
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.03.202.
  • 査読あり
• [雑誌論文] IRS-2 deubiquitination by USP9X maintains anchorage-independent cell growth via Erk1/2 activation in prostate carcinoma cell line. (2018)
  • 著者名/発表者名: Furuta Haruka, Yoshihara Hidehito, Fukushima Toshiaki, Yoneyama Yosuke, Ito Akihiro, Worrall Claire, Girnita Ada, Girnita Leonard, Yoshida Minoru, Asano Tomoichiro, Komada Masayuki, Kataoka Naoyuki, Chida Kazuhiro, Hakuno Fumihiko, Takahashi Shin-Ichiro
  • 雑誌名: Oncotarget 巻: 9(74) ページ: 33871-33883
  • DOI: 10.18632/oncotarget.26049.
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Nrk’s role in breast cancer (2018)
  • 著者名/発表者名: Denda Kimitoshi, Hayashi Nobuhiro, Fukushima Toshiaki
  • 雑誌名: Impact 巻: 2018 ページ: 76-78
  • DOI: https://doi.org/10.21820/23987073.2018.12.76
• [学会発表] USP8遺伝子変異によるクッシング病発症機構解明の新展開 (2019)
  • 著者名/発表者名: 福嶋俊明
  • 学会等名: 第2回ユビキチン研究会
• [学会発表] 脱ユビキチン化酵素USP8の自己活性抑制機構 (2019)
  • 著者名/発表者名: 柿原慧遵、 浅水謙吾、 遠藤彬則、 駒田雅之、福嶋俊明
  • 学会等名: 第2回ユビキチン研究会
• [学会発表] Nuclear localization mechanism of deubiquitinating enzyme USP8 in Cushing’s disease. (2018)
  • 著者名/発表者名: Takahiro Sawada, Kazuya Inoko, Kohei Kawaguchi, Akinori Endo, Yasushi Saeki, Keiji Tanaka, Toshiaki Fukushima, Masayuki Komada
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] Molecular mechanisms underlying the control of Nrk protein levels and Nrk-mediated anti-proliferation effects. (2018)
  • 著者名/発表者名: Satomi Naito, Akinori Endo, Toshiaki Fukushima, Kimitoshi Denda, Akira Kato, Masayuki Komada
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] A deubiquitinase USP8, a master regulator of endosome-centered membrane traffic, controls inter-cellular signal transduction. (2018)
  • 著者名/発表者名: Akinori Endo, Toshiaki Fukushima, Masayuki Komada
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] USP8, a deubiquitinating enzyme in the endocytic pathway, plays roles in proteostasis in the secretory pathway. (2018)
  • 著者名/発表者名: Toshiaki Fukushima
  • 学会等名: Tokyo Tech WRHI-Cell Biology Center Mini-Symposium on Proteostasis in the Cell
  • 招待講演
• [学会発表] USP8 遺伝子のゲノム編集によるCushing 病モデル細胞の作製と解析 (2018)
  • 著者名/発表者名: Suguru Machidori, Kazuya Inoko, Kohei Kawaguchi, Akinori Endo, Toshiaki Fukushima, Masayuki Komada
  • 学会等名: The 33th Japanese Society of Pituitary Research Meeting
• [学会発表] Ubiquitin-specific protease 8 suppresses collagen secretion by deubiquitinating Sec31. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kohei Kawaguchi, Akinori Endo, Toshiaki Fukushima, Masayuki Komada
  • 学会等名: Cell and Developmental Biology Meeting
• [学会発表] Deubiquitinases USP5 and USP13 are recruited to and regulate heat-induced stress granules by deubiquitinating activities. (2018)
  • 著者名/発表者名: Xie Xuan, Shunsuke Matsumoto, Akinori Endo, Toshiaki Fukushima, Hiroyuki Kawahara, Yasushi Saeki, Masayuki Komada
  • 学会等名: Cold Spring Harbor Asia Conferences, Ubiquitin Family, Autophagy and Diseases
• [備考] 東京工業大学 科学技術創成研究院 細胞制御工学研究センター 駒田研究室
  • URL: https://komada-lab.jimdo.com/
• [備考] 動物の成長や細胞の増殖の新しい調節機構を発見 (東京大学、UTokyo Research)*
  • URL: http://www.u-tokyo.ac.jp/en/utokyo-research/research-news/novel-regulatory-mechanisms-of-animal-growth-and-cell-proliferation.html
• [備考] 東京大学 大学院農学生命科学研究科 動物細胞制御学研究室
  • URL: http://endo.ar.a.u-tokyo.ac.jp/shingroup/index.html
• [備考] 広島大学 医歯薬保健学研究院 医化学研究室
  • URL: http://home.hiroshima-u.ac.jp/ikagaku/
• [産業財産権] クッシング病治療剤のスクリーニング方法 (2018)
  • 発明者名: 福嶋俊明
  • 権利者名: 国立大学法人東京工業大学
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: 2018-244180