研究課題/領域番号 |
17K08635
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研究機関 | 徳島大学 |
研究代表者 |
小迫 英尊 徳島大学, 先端酵素学研究所(オープンイノベ), 教授 (10291171)
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研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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キーワード | パーキンソン病 / PINK1 / キナーゼ / リン酸化 / 相互作用 / 質量分析 / プロテオーム / シグナル伝達 |
研究実績の概要 |
家族性パーキンソン病の原因遺伝子産物として、セリン/スレオニンキナーゼPINK1 とユビキチン連結酵素Parkin が知られている。近年、PINK1 とParkin が協調して損傷ミトコンドリア上にリン酸化ユビキチン鎖を形成することにより、損傷ミトコンドリア特異的なオートファジー分解を引き起こすことが明らかになった。しかしながら、PINK1のミトコンドリアでの複合体形成やPINK1の下流シグナル伝達系については不明な点が多い。そこで本年度は、免疫沈降-質量分析(IP-MS)法により、PINK1と相互作用する因子を網羅的に同定することを試みた。その結果、1,053種類のタンパク質の同定と定量に成功し、PINK1自身やTom複合体構成因子などと共に、キナーゼシャペロンであるCdc37や様々なミトコンドリアタンパク質を新たなPINK1相互作用因子の候補として見出した。さらに一部の因子については、免疫沈降物のウェスタンブロットによってPINK1と相互作用することを確認した。この中には昨年度に大規模定量リン酸化プロテオミクスによって見出したPINK1基質候補とオーバーラップするものがあった。そこで本因子とPINK1を細胞内に共発現させることにより、両者が相互作用することと本因子がPINK1依存的にリン酸化されることを再確認した。次年度は本因子を中心として、ミトコンドリアの損傷に伴うPINK1の複合体形成への影響やPINK1によるリン酸化の機能的意義を明らかにする予定である。
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現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
PINK1との相互作用因子を網羅的に同定するために、磁気ビーズを用いた免疫沈降、ビーズ上酵素消化、LC-MS/MS、ラベルフリー定量解析のシステムを確立することができた。その結果、約1千種類もの相互作用因子の候補を同定・定量することに成功した。この中でミトコンドリア損傷によるPINK1の安定化に依存して相互作用が増加するタンパク質には、Tom20やTom40などのTom複合体の構成因子が含まれていたため、本方法の妥当性が確認できた。この網羅的な相互作用解析法は他のタンパク質にも適用可能な汎用性の高い方法である。
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今後の研究の推進方策 |
ミトコンドリアの損傷に依存してPINK1と相互作用し、かつPINK1によってリン酸化されるミトコンドリアタンパク質を同定することができたため、このリン酸化の機能的意義およびミトコンドリアの損傷に伴うPINK1の活性化・局在変化・安定化・複合体形成などにおける役割を明らかにする。
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次年度使用額が生じた理由 |
免疫沈降-質量分析法によってPINK1との相互作用因子を網羅的に同定する実験は、条件検討のために繰り返し行う予定であった。しかしながら、2度目の実験で信頼性の高い結果が得られたため、当該実験にかかる費用が当初予定よりも少なくなった。次年度に持ち越した研究費は新たに同定したPINK1シグナル関連因子の機能解析の費用に充当する予定である。
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