| 研究課題/領域番号 |
17K08643
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| 研究機関 | 高崎健康福祉大学 |
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研究代表者 |
大森 慎也 高崎健康福祉大学, 薬学部, 助教 (10509194)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | GATA1 / GATA2 / PU.1 / Cebpa / マスト細胞 / 転写制御 |
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| 研究実績の概要 |
申請者らは成熟マスト細胞において転写因子GATA2は骨髄球分化で中心的な役割を担うCebpaの転写を抑制することでマスト細胞の分化形質を維持していることをGATA2コンディショナルノックアウトマウス由来の骨髄由来マスト細胞を用いて明らかにした(Ohmori et al., blood, 2015)。しかしその抑制メカニズムの詳細は明らかとなっていない。転写因子GATA2とC/EBPαは、共に血球分化における「鍵因子」である。本研究課題では、BMMCsをプロトタイプとし、GATA2によるCebpa転写抑制メカニズムを明らかにすることで、血球分化全体におけるCebpaの転写抑制メカニズムを解明することを目的とした。
初年度は研究計画書に従いGATA2欠失時の転写因子の挙動に着目し解析した。公開されているChIP-Sequenceのデータをもとに野生型BMMCsのCebpa遺伝座におけるGATA2、PU.1、RUNX1、SCL、LMO2の結合を調べた結果、共通して+37K領域に結合が認められた。ところがCRISPR/Cas9法によりマスト細胞株で+37K領域を欠失させてもGATA2欠失時のCebpaの発現上昇は維持されていた。そこでCebpaの発現増加に関与する+37K以外のシス領域とトランス因子を同定するため、BMMCsを用いてGATA2の欠失と同時に前述した幾つかの転写因子についてsiRNAを導入しKDを行った。その結果、PU.1をKDした時Cebpaの発現上昇が約半分に低下した。次にGATA2欠失BMMCsにおけるPU.1のCebpa遺伝子座に対する結合を調べた結果、+37K領域のみならず複数のシス領域で上昇しており、PU.1はCebpaの正の制御因子であると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
申請書において初年度は以下に記す３つの実験を計画しそれぞれ予定通り実施した。①Cebap遺伝子座に対する各転写因子の結合変化の検証、②GATA2欠失時のCebpaの転写開始に重要な因子の同定、③Cebpa転写抑制におけるCebpa +37KGATAの重要性をゲノム編集によって明らかにする。①②ではGATA2欠失時に大きく結合様式が変化する因子としてPU.1を同定し、またGATA2欠失時のCebpaの発現上昇にPU.1が関与していることを明らかにした。③に関しては細胞株を用いてCRISPR/Cas9法を行い、GATA2欠失時のCebpaの発現上昇には、+37K領域以外の領域が働いている可能性を示唆する結果を得た。以上ことから予定した計画通り実施しそれぞれについて結果を得ることができたことから、おおむね順調に進展していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
初年度の解析によって、GATA2欠失時のCebpaの発現上昇にはPU.1が関与している可能性が高まった。次年度は、この結果について当研究室で系統維持されているPU.1flox/floxマウスとGATA2flox/floxマウスを交配し、PU.1/GATA2ダブルコンディショナルノックアウトマウスを得て、さらに解析を進める予定である。同時に、申請書の計画通りCebpa転写活性化に伴うヒストン修飾の変化について検討を進める。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
次年度にChIP-Sequenceを計画しているため、その費用として次年度に繰り越した。
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