| 研究課題/領域番号 |
17K08651
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| 研究機関 | 東京医科歯科大学 |
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研究代表者 |
藤川 誠 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (90573048)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | GSIS / エネルギー代謝 / ATP合成 / インスリン |
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| 研究実績の概要 |
前年度にミオシン軽鎖りん酸化酵素であるMLCKのノックダウンおよび阻害剤を用いた実験から、既に我々が報告していたHeLa細胞を用いた研究と同様にマウス膵島β細胞由来インスリノーマMIN6細胞においてもMLCKがミトコンドリアFoF1-ATP合成酵素によるATP合成に寄与しているだけでなく、さらにグルコース刺激依存性インスリン分泌(GSIS)にも寄与していることを明らかにした。本年度はMLCKの活性型および不活性型変異体を一過的に発現させてATP合成およびGSISへの影響を調べた。MIN6細胞に一過的にMLCK変異体を発現させようとしたが、発現量が不十分であった。そこで、アデノウイルスおよびレトロウイルスを利用した異所的発現を行った。一過的に大過剰させたり安定的に全てのMIN6細胞にMLCK変異体を発現させることに成功した。ところが、MLCK不活性型変異体を発現させてもノックダウンや阻害剤と同様の効果を得なかった。
昨年度、生細胞のATPをリアルタイムに測定することが可能なFRETプローブであるATeamを発現させたMIN6細胞を用いてGSIS時のATP変動を見ようとしたが、ATeam発現が過剰であるため(恐らく飽和して)ATP変動を検出できなかったため、TetOnシステムを利用したATeamプローブの発現量を調節できるクローナルなMIN6細胞を構築した。
ストレプトゾトシン投与で誘導した糖尿モデルマウスから膵臓・膵島を単離してGSISを観察した。ただし、ストレプトゾトシンではβ細胞が死滅するため、今後の高脂肪食で誘導した糖尿病マウスを用いて同様の実験を行う。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
MIN6細胞に一過的かつ異所的にMLCKを発現させるためトランスフェクション法を用いるも十分な発現量が得られず、アデノウイルスベクターを構築し大過剰の発現系を構築した。しかし、ノックダウンや阻害剤の実験で得られた結果に反して不活性型MLCKの過剰発現ではGSISに影響を及ぼさなかった。またin/ex vivoでMLCK機能を調べるため高脂肪食で誘導した糖尿病マウス作成の許可が下りず (2018年5月)、遅々として進まなかった。ただ、2019年1月に承認を得たので2019年度には実施できると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
MIN6細胞のMLCKをノックダウンしたりMLCK阻害剤を投与するとGSISが減弱しATP合成量も低下することから、呼吸鎖、特にFoF1-ATP合成酵素複合体に着目し、MLCKが及ぼすエネルギー合成系への影響について分子レベルで解明することを目指す。
TetOn発現誘導系を利用したATeamの発現量を調節したMIN6細胞を用いてGSIS時におけるATP変動とMLCKの寄与を調べる。
高脂肪食により誘導した糖尿病マウスから摘出した膵島β細胞のATP合成活性、MLCK発現・呼吸鎖複合体の状態について生化学的および分子生物学的な解析を行い、GSISにおけるMLCKの役割をex vivoで調べる。
上記解析結果を踏まえた研究成果を次年度に国際学術誌に公表する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
1000円未満となり必要試薬などの購入には足りず、次年度に執行を持ち越した。
本年度予算と合わせて必要試薬などの購入に充てる。
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