| 研究課題/領域番号 |
17K08656
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| 研究機関 | 福井大学 |
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研究代表者 |
定 清直 福井大学, 学術研究院医学系部門, 教授 (10273765)
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| 研究分担者 |
千原 一泰 福井大学, 学術研究院医学系部門, 准教授 (00314948)
竹内 健司 福井大学, 学術研究院医学系部門, 助教 (40236419)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | チロシンキナーゼ / C型肝炎ウイルス / ゲノム編集 / アダプタータンパク質 |
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| 研究実績の概要 |
我々はウイルスや真菌・結核菌などの病原体に対する新しい宿主因子として、チロシンキナーゼAblとSyk、さらにその関連分子であるAbl会合分子アダプタータンパク質3BP2の役割について研究を進めてきた。本研究課題の計画調書提出後、ゲノム編集（CRISPR/Cas9システム）によりSTAT1～6とIRF9を欠損する培養肝細胞を作成し、STAT1がインターフェロンλによるC型肝炎ウイルス（HCV）の複製抑制に不可欠であることを明らかにした。この成果を踏まえて、ゲノム編集による様々な宿主因子の欠損細胞を用いて、ウイルスの生活環における宿主因子の役割について解析することを計画している。昨年度はゲノム編集によりAblを欠損する培養肝細胞（Huh7.5細胞）を樹立した。Abl欠損細胞と対照細胞とを用いて、HCVの感染から子ウイルス出芽までの生活環への影響について検証を行ったところ、Abl欠損細胞株は対照細胞と比べウイルス産生能が低下していることが明らかとなった。現在、Abl欠損細胞株に再びAblを構成的に発現する細胞株の樹立を試みており、ウイルス産生能が回復するかどうかを検討する予定である。さらにAblとHCVの非構造タンパク質NS5Aを一過性に強制発現したところ、NS5AはAblの活性化因子としても作用することが示唆された。また現在研究を進めている3BP2の役割については、培養マクロファージを用いた研究が昨年度までに完了したため、今年度は3BP2がSykの基質であることを明らかにした。現在ゲノム編集により変異型3BP2（Sykによるリン酸化部位に変異を加えたもの）のノックインマウスを作成中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
昨年の報告書にも記載したが、我々のグループのほかにHCVの肝細胞への侵入過程においてもAblが関与するとの報告が他のグループからなされた。よってAbl欠損Huh7.5細胞の樹立を研究計画のなかで優先することとした。Abl欠損細胞と対照細胞とを用いて、HCVの感染から子ウイルス出芽までの生活環への影響について網羅的に検証を行った。その結果、Abl欠損細胞株では細胞内でのウイルス粒子形成への影響は見られなかったが、細胞外へのウイルス産生能は低下していることが明らかとなった。現在、Abl欠損細胞株に再びAblタンパク質を構成的に発現するような安定細胞株の樹立を試みており、Abl欠損細胞で見られたウイルス産生能の低下が回復するかどうかを検討する予定である。一方、チロシンキナーゼAbl結合タンパク質であるアダプタータンパク質3BP2については、培養マクロファージを用いた研究が完了し、今年度は新たに3BP2がSyk基質であること、さらに183番目のチロシンがSykによるリン酸化部位であることを再構成実験によって証明した。現在ゲノム編集により変異型3BP2（Sykによるリン酸化部位である183番目のチロシン残基をフェニルアラニンに置換したもの）ノックインマウス、さらに3BP2ノックアウトマウスを作成中である。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度も当初の研究計画に従い、以下のように推進する予定である。
当初の計画通り、Abl欠損細胞と対照細胞とを用いて、感染後にインターフェロンを投与することにより、インターフェロン刺激遺伝子（ISG）についてマイクロアレイにより網羅的解析を行い、定量PCRやプロテオーム解析によりAbl制御性の新規ISGを同定する。更にゲノム編集により新規ISG欠損細胞を作成し、Abl阻害薬であるイマチニブの効果についても同時に検証する。アダプタータンパク質3BP2についてはゲノム編集による変異型3BP2のノックインマウスと3BP2欠損マウスを樹立する。遺伝子改変マウスの樹立にはバッククロスの過程で一定の時間を要するために、本年度は1年間をほぼそのために費やした。次年度は広く免疫系細胞の分化・成熟や免疫応答に対する影響について解析を進める予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
原因として最も大きな要因は、平成29年度に実施予定であったウイルス粒子形成過程の生化学的解析、細胞内ウイルス分布の組織学的解析を30年度に移動させたことである。この理由については昨年度の報告書にも記載したが、その分平成30年度の計画も後倒しとなった。次年度はこれらの解析を実施する予定である。
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