PCSK9 の遺伝子変異及び分子型が生活習慣病に及ぼす影響とその制御機構の解明

2018 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K08681
• 研究機関: 国立研究開発法人国立循環器病研究センター
• 研究代表者: 堀 美香 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (60598043)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 家族性高コレステロール血症 / PCSK9 / 脂質異常症 / 変異 / 肝細胞 / iPS細胞

研究実績の概要

当該年度は、当センターを受診した家族性高コレステロール血症 (FH) 患者229名において、LDLR・PCSK9 遺伝子のコード領域・エクソンイントロン接合部をサンガー法にて解析し、遺伝子型と臨床データの解析から、LDLR 遺伝子1アレル変異に、PCSK9 遺伝子V4I 変異もしくはE32K変異が重なることで、FH の予後が悪くなることを明らかにした (Doi, Hori et al. in preparation)。また、当院/全国のFH患者 801名について、遺伝子型と臨床データの解析により検出された変異についてACMG ガイドラインに従ってアノテーションを行った。その結果、92種類の LDLR 遺伝子変異ならびに4種類のPCSK9 遺伝子変異は病的変異であることを明らかにした。本邦のFH 患者では、PCSK9 遺伝子については、V4I 変異及びE32K 変異が高頻度に検出されるが、アノテーションにより、E32K 変異はFH の病態に寄与するがV4I 変異単独では FH の病態に寄与しないことを明らかにした (Hori et al. in revision)。また、ヒト肝細胞HepG2・HEK293株に PCSK9 E32K/V4I 変異体を導入し、LDLRの発現・活性、PCSK9の発現・分泌量を調べたが野生型と差は認められなかった (Hori et al. in preparation)。しかしながら、この実験系ではLDLR 遺伝子は正常であり、LDLR 遺伝子1アレル変異を有する患者におけるPCSK9 遺伝子E32K・V4I 変異のFHの病態への寄与は不明である。そこで、患者の末梢血から iPS 細胞を樹立する技術を確立し、LDLR 遺伝子1アレル変異とPCSK9 遺伝子V4I 変異を有する家系について、iPS 細胞由来の肝細胞の機能解析のため、研究同意を取得してiPS 細胞を樹立している。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

本年度は、本邦のFH で検出された LDLR・PCSK9 遺伝子のアノテーションを行い、現在投稿論文を修正している (Hori et al. in revision)。また、PCSK9遺伝子V4I 変異ならびに E32K 変異については、マウスではこの変異部位のアミノ酸配列がヒトの配列と一致しないことから、LDLR 遺伝子変異ならびにPCSK9 遺伝子V4I 変異もしくはE32K 変異を有する患者について iPS 細胞樹立後、肝細胞を作製して機能解析することとした。また、マウスでは血中のコレステロールの大部分がHDLに存在しており、ヒトのリポ蛋白質代謝と大きく異なり、動脈硬化も起こりにくい。マウスではHDL 中のコレステロールを VLDL や LDL に積み替えて末梢で利用するためのコレステリルエステル輸送タンパク (CETP) 蛋白質が欠損していることがこの理由であり、ヒトのリポ蛋白質代謝と同様のモデルとして、hCETP 遺伝子改変マウスを作製し、hPCSK9 遺伝子改変マウスと交配することにした。このため、研究計画の内容とは異なるが、おおむね順調に進展していると考える。

今後の研究の推進方策

LDLR 遺伝子1アレル変異とPCSK9 遺伝子変異を有する家系について、iPS 細胞から肝細胞を作製し、機能評価を行う。その結果、本邦特有の PCSK9 遺伝子変異が FH や脂質異常症の病態に与える影響を明らかにする。

次年度使用額が生じた理由

本年度は主に本邦で検出されるLDLR・PCSK9遺伝子変異のアノテーションを実施し、論文作成・投稿したため、次年度使用額が生じた。残高は、ヒトFH疾患モデル作製のための iPS 細胞樹立、肝細胞作製やhCETPマウスの作製費用に充てる。

研究成果

• [雑誌論文] Humoral factors secreted from adipose tissue-derived mesenchymal stem cells ameliorate atherosclerosis in Ldlr-/- mice. (2019)
  • 著者名/発表者名: Takafuji Y, Hori M , Mizuno T, Harada-Shiba M
  • 雑誌名: Cardiovascular Research 巻: 115 ページ: 1041-1051
  • DOI: 10.1093/cvr/cvy271
  • 査読あり
• [雑誌論文] Detection of the benign c.2579C>T (p.A860V) variant of the LDLR gene in a pedigree-based genetic analysis of familial hypercholesterolemia. (2019)
  • 著者名/発表者名: Hori M, Miyauchi E, Son C, Harada-Shiba M
  • 雑誌名: Jounral of Clinical Lipidology 巻: 13 ページ: 335-339
  • DOI: 10.1016/j.jacl.2019.01.004
  • 査読あり
• [雑誌論文] Discontinuation of LDL apheresis with evolocumab in an FH patient with a duplication of exon 2-6 in the LDLR gene. (2019)
  • 著者名/発表者名: Nose D, Hori M, Miyamoto Y, Imaizumi S, Harada-Shiba M, Saku K, Miura S
  • 雑誌名: Journal of Cardiology Cases. 巻: 19 ページ: 55-58
  • DOI: 10.1016/j.jccase.2018.10.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] Pharmaceutical research for inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cell and genome editing technologies. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamashita T, Takayama K, Hori M, Harada-Shiba M, Mizuguchi H
  • 雑誌名: Biological and Pharmaceutical Bulletin 巻: 42 ページ: 312-318
  • DOI: 10.1248/bpb.b18-00544
  • 査読あり
• [雑誌論文] A case of coronary artery plaque regression by a PCSK9 antibody and rosuvastatin in double-heterozygous familial hypercholesterolemia with an LDLR mutation and a PCSK9 V4I mutation. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shirahama R, Ono T, Nagamatsu S, Sueta D, Takashio S, Chitose T, Fujisue K, Sakamoto K, Yamamoto E, Izumiya Y, Kaikita K, Hokimoto S, Hori M, Harada-Shiba M, Kajiwara I, Ogawa H, Tsujita K
  • 雑誌名: Internal Medicine 巻: 57 ページ: 3551-3557
  • DOI: 10.2169/internalmedicine.1060-18
  • 査読あり
• [雑誌論文] Fatty pancreas: A possible risk factor for pancreatic cancer in animals and humans. (2018)
  • 著者名/発表者名: Takahashi M, Hori M, Ishigamori R, Mutoh M, Imai T, Nakagama H
  • 雑誌名: Cancer Science 巻: 109 ページ: 3013-3023.
  • DOI: 10.1111/cas.13766.
  • 査読あり
• [学会発表] Role of PCSK9 as a modifier in familial hypercholesterolemia. (2018)
  • 著者名/発表者名: Hori M, Harada-Shiba M.
  • 学会等名: 第50回日本動脈硬化学会総会・学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] Prevalence, Clinical Characteristics and Cardiovascular Outcomes in Heterozygous Familial Hypercholesterolemia Patients with Double-heterozygous Mutation of LDLR and PCSK9 Gain-of-function Mutation. (2018)
  • 著者名/発表者名: Doi T, Hori M, Harada-Shiba M, Kataoka Y, Nishikawa R, Tsuda K, Nishimura K, Ogura M, Noguchi T, Yasuda S.
  • 学会等名: American Heart Association
  • 国際学会
• [学会発表] The Frequency and the Spectrum of Causative Mutations in Japanese Familial Hypercholesterolemia Heterozygotes (2018)
  • 著者名/発表者名: Hori M, Ohta N, Masuda H, Son C, Hosoda K, Ogura M, Miyamoto Y, Harada-Shiba M
  • 学会等名: 86th EAS Congress
  • 国際学会
• [学会発表] FHホモ接合体におけるコレステロール引き抜き能 (2018)
  • 著者名/発表者名: 小倉正恒, 堀美香, 斯波真理子
  • 学会等名: 第50回日本動脈硬化学会総会・学術集会
• [学会発表] 家族性高コレステロール血症ヘテロ接合体における遺伝子診断とLDLR/PCSK9遺伝子変異の分布 (2018)
  • 著者名/発表者名: 堀美香, 太田直孝, 増田弘明, 磯田理恵子, 孫徹, 小倉正恒, 細田公則, 宮本恵宏, 斯波真理子
  • 学会等名: 第55回日本臨床分子医学会学術集会