着床後に確立する体細胞性インプリントＤＭＲの確立制御因子同定と分子機構の解明

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K08687
• 研究機関: 佐賀大学
• 研究代表者: 副島 英伸 佐賀大学, 医学部, 教授 (30304885)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: ゲノムインプリンティング / DNAメチル化 / メチル化可変領域 / 遺伝子発現

研究実績の概要

インプリント遺伝子の発現制御の中心はgametic DMR（gDMR）と考えられてきたが、我々は、somatic DMR（sDMR）も遺伝子発現制御に重要で病態に関与していることを明らかにしてきた。しかし、sDMRに関する知見は少なく、特に発生初期の着床後にsDMRが確立する分子機構については未解明である。本研究では、マウスのインプリンティング座位Igf2r/Airn領域を対象にshRNAライブラリースクリーニングを用いてsDMR確立に関する制御因子を同定し、その分子機構を明らかにする。shRNAライブラリーは、9,145のマウス遺伝子を55,000のshRNAでカバーしている。
一次スクリーニングで得られた候補遺伝子の中から、遺伝子機能を考慮して６種に絞り込み、用いたshRNAライブラリーに含まれる当該遺伝子に対するshRNAと同じ配列を持つshRNAレンチウィルスを用いてそれぞれの遺伝子を個別にknockdown（KD）することで二次スクリーニングを行った。しかし、KD効率が予想外に悪く、DNAメチル化解析、遺伝子発現解析ができなかった。そこで、CRISPR-Cas9システムを用いてknockout（KO）することした。各遺伝子に対して複数のgRNAをデザインし、ES細胞へ導入し、それぞれのgRNAについて複数のKOクローンを得た。標的部位におけるindelを確認したのち、インプリント遺伝子（Igf2r, Airn）のアレリックな発現状態およびDMRのメチル化状態を解析しているところである。これまでに、６種の候補遺伝子のうち２種類については、インプリント遺伝子発現状態およびDMRのメチル化状態に変化が認められなかったため、sDMR確立に関する制御因子ではないことが示唆された。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

一次スクリーニングに用いたshRNAと同じ配列を用いて二次スクリーニングを行ったが、KD効率が予想外に悪く、CRISPR-Cas9システムを用いてKOすることした。CRISPR-Cas9システムのために、各遺伝子に対するgRNAのデザイン、ベクターの作成、KOクローンの取得、標的部位における変異の確認などに時間がかかった。

今後の研究の推進方策

１．候補遺伝子として残っている4種類の遺伝子について、CRIPSR-Cas9システムによる二次スクリーニングを行う。この際、コントロールとしてDnmt1のKO細胞を作成する。また、KO（両アレルKO）だけでなく、ハプロ不全による影響も考慮し、KOヘテロ接合細胞も解析対象とする。
２．二次スクリーニングで陽性となった遺伝子のChIP解析により、Igf2r/Airn領域のsDMRへの結合の有無および結合アレルを解析する。また、RNA免疫沈降法（RIP）によりAirn (noncoding RNA)への結合の有無を解析する。
３．クロマチン構造解析
制御因子自身に対する抗体を用いて、ChIA-PET法（Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing）を行い制御因子によるクロマチンループ構造を明らかにする。市販の抗体が使えない場合は、当該制御因子のC末端に3xFLAGタグを付加した細胞を作製し、抗FLAG抗体を用いて解析する。

次年度使用額が生じた理由

各種試薬の節約、効率的な使用方法により出費を抑えることができた。また、講座費等で一部分を賄った。
次年度は、主として二次スクリーニング（細胞培養、DNAメチル化解析、遺伝子発現解析）およびChIP解析に必要な消耗品に研究費を充てる。その他、成果発表のための旅費、英文校正費等に使用する予定である。

研究成果

• [雑誌論文] Mbf1 ensures Polycomb silencing by protecting E(z) mRNA from degradation by Pacman (2018)
  • 著者名/発表者名: Nishioka Kenichi、Wang Xian-Feng、Miyazaki Hitomi、Soejima Hidenobu、Hirose Susumu
  • 雑誌名: Development 巻: 145 ページ: dev162461
  • DOI: doi.org/10.1242/dev.162461
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The allele frequency ofALDH2*Glu504LysandADH1B*Arg47Hisfor the Ryukyu islanders and their history of expansion among East Asians (2017)
  • 著者名/発表者名: Koganebuchi Kae、Haneji Kuniaki、Toma Takashi、Joh Keiichiro、Soejima Hidenobu、Fujimoto Kazuma、Ishida Hajime、Ogawa Motoyuki、Hanihara Tsunehiko、Harada Shoji、Kawamura Shoji、Oota Hiroki
  • 雑誌名: Am J Hum Biol 巻: 29 ページ: e22933
  • DOI: 10.1002/ajhb.22933
  • 査読あり
• [雑誌論文] Long term survival of a patient with Perlman syndrome due to novel compound heterozygous missense mutations in RNB domain ofDIS3L2 (2017)
  • 著者名/発表者名: Soma Noriko、Higashimoto Ken、Imamura Masaru、Saitoh Akihiko、Soejima Hidenobu、Nagasaki Keisuke
  • 雑誌名: Am J Med Genet Part A 巻: 173 ページ: 1077～1081
  • DOI: 10.1002/ajmg.a.38111
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mutations in genes encoding polycomb repressive complex 2 subunits cause Weaver syndrome (2017)
  • 著者名/発表者名: Imagawa Eri、Higashimoto Ken、Sakai Yasunari、Numakura Chikahiko、Okamoto Nobuhiko、Matsunaga Satoko、Ryo Akihide、Sato Yoshinori、Sanefuji Masafumi、Ihara Kenji、Takada Yui、Nishimura Gen、Saitsu Hirotomo、Mizuguchi Takeshi、Miyatake Satoko、Nakashima Mitsuko、Miyake Noriko、Soejima Hidenobu、Matsumoto Naomichi
  • 雑誌名: Hum Mutat 巻: 38 ページ: 637～648
  • DOI: 10.1002/humu.23200
  • 査読あり
• [雑誌論文] An ancestral haplotype of the human PERIOD2 gene associates with reduced sensitivity to light-induced melatonin suppression (2017)
  • 著者名/発表者名: Akiyama Tokiho、Katsumura Takafumi、Nakagome Shigeki、Lee Sang-il、Joh Keiichiro、Soejima Hidenobu、Fujimoto Kazuma、Kimura Ryosuke、Ishida Hajime、Hanihara Tsunehiko、Yasukouchi Akira、Satta Yoko、Higuchi Shigekazu、Oota Hiroki
  • 雑誌名: PLoS One 巻: 12 ページ: e0178373
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0178373
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Differences in the Genotype Frequency of the RNF213 Variant in Patients with Familial Moyamoya Disease in Kyushu, Japan (2017)
  • 著者名/発表者名: TAKAMATSU Yuichiro、HIGASHIMOTO Ken、MAEDA Toshiyuki、KAWASHIMA Masatou、MATSUO Muneaki、ABE Tatsuya、MATSUSHIMA Toshio、SOEJIMA Hidenobu
  • 雑誌名: Neurol Med Chir 巻: 57 ページ: 607～611
  • DOI: 10.2176/nmc.oa.2017-0036
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] CTCFdeletion syndrome: clinical features and epigenetic delineation (2017)
  • 著者名/発表者名: Hori Ikumi、Kawamura Rie、Nakabayashi Kazuhiko、Watanabe Hidetaka、Higashimoto Ken、Tomikawa Junko、Ieda Daisuke、Ohashi Kei、Negishi Yutaka、Hattori Ayako、Sugio Yoshitsugu、Wakui Keiko、Hata Kenichiro、Soejima Hidenobu、Kurosawa Kenji、Saitoh Shinji
  • 雑誌名: J Med Genet 巻: 54 ページ: 836～842
  • DOI: 10.1136/jmedgenet-2017-104854
  • 査読あり
• [学会発表] Mbf1はPacmanからE(z) mRNAを保護することでポリコームサイレンシングの堅牢性を担保している (2017)
  • 著者名/発表者名: 西岡憲一、宮崎仁美、副島英伸、広瀬進
  • 学会等名: 第11回日本エピジェネティクス研究会年会
• [学会発表] マウスCommd1とZrsr1のゲノムインプリンティング機構の研究 (2017)
  • 著者名/発表者名: 城 圭一郎、西岡憲一、北嶋修司、松久葉一、古関明彦、河野友宏、副島英伸
  • 学会等名: 第11回日本エピジェネティクス研究会年会
• [学会発表] 大腸癌におけるインプリントDMRの包括的メチル化解析 (2017)
  • 著者名/発表者名: 樋高秀憲、東元健、青木早織、渡邊英孝、前田寿幸、古賀靖大、岩切龍一、能城浩和、藤本一眞、副島英伸
  • 学会等名: 第11回日本エピジェネティクス研究会年会
• [学会発表] NSD1ハプロ不全はDNAメチル化インプリント異常と遺伝子発現異常を惹起する (2017)
  • 著者名/発表者名: 渡邊英孝、東元健、三宅紀子、前田寿幸、樋高秀憲、青木早織、八木ひとみ、西岡憲一、城圭一郎、松本直通、副島英伸
  • 学会等名: 第11回日本エピジェネティクス研究会年会
• [学会発表] ゲノムインプリンティングのoverviewとBeckwith-Wiedemann症候群 (2017)
  • 著者名/発表者名: 副島英伸
  • 学会等名: 日本人類遺伝学会第62回大会
  • 招待講演
• [学会発表] NSD1ハプロ不全はDNAメチル化インプリント異常と遺伝子発現異常を惹起する (2017)
  • 著者名/発表者名: 渡邊英孝、東元健、三宅紀子、前田寿幸、樋高秀憲、青木早織、八木ひとみ、西岡憲一、城圭一郎、松本直通、副島英伸
  • 学会等名: 日本人類遺伝学会第62回大会
• [学会発表] ポリコーム抑制複合体２の構成蛋白質の遺伝子変異がWeaver症候群を引き起こす (2017)
  • 著者名/発表者名: 今川英里、東元健、酒井康成、沼倉周彦、岡本伸彦、松永智子、梁明秀、佐藤由典、實藤雅文、井原健二、高田結、西村玄、才津浩智、水口剛、宮武聡子、中島光子、三宅紀子、副島英伸、松本直通
  • 学会等名: 日本人類遺伝学会第62回大会
• [学会発表] 間葉性異形成胎盤とインプリンティング異常 (2017)
  • 著者名/発表者名: 副島英伸
  • 学会等名: 第25回日本胎盤学会学術集会
  • 招待講演
• [学会発表] Mbf1はPacmanからE(z) mRNAを保護することでポリコームサイレンシングの堅牢性を担保している (2017)
  • 著者名/発表者名: 西岡憲一、宮崎仁美、副島英伸、広瀬進
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] マウスCommd1とZrsr1のゲノムインプリンティング機構の研究 (2017)
  • 著者名/発表者名: 城 圭一郎、西岡憲一、北嶋修司、松久葉一、古関明彦、河野友宏、副島英伸
  • 学会等名: 2017年度生命科学系学会合同年次大会
• [学会発表] Beckwith-Wiedemann症候群に合併した後縦隔神経芽腫の1例 (2017)
  • 著者名/発表者名: 川口晃司、卜部馨介、高橋郁子、小倉妙美、堀越泰雄、東元 健、副島英伸、渡邉健一郎
  • 学会等名: 第73回東海小児がん研究会
• [学会発表] NSD1 haploinsufficiency evokes DNA hypomethylation at imprinted DMRs and the increased expression of imprinted genes (2017)
  • 著者名/発表者名: Watanabe H, Higashimoto K, Miyake N, Maeda T, Hidaka H, Aoki S, Matsumoto N, Soejima H
  • 学会等名: The 67th Annual Meeting of the American Society of Human Genetics
• [学会発表] Germline mutations associated with polycomb repressive complex 2 cause Weaver syndrome (2017)
  • 著者名/発表者名: Imagawa E, Higashimoto K, Sakai Y, Numakura C, Okamoto N, Matsunaga S, Ryo A, Sato Y, Sanefuji M, Ihara K, Takada Y, Nishimura G, Saitsu H, Mizuguchi T, Miyatake S, Nakashima M, Miyake N, Soejima H, Matsumoto N
  • 学会等名: The 67th Annual Meeting of the American Society of Human Genetics
• [図書] DNA and Histone Methylation as Cancer Targets (2017)
  • 著者名/発表者名: Higashimoto K, Joh K, Soejima H
  • 総ページ数: 622
  • 出版者: Humana Press
• [備考] 佐賀大学医学部分子生命科学講座分子遺伝学・エピジェネティクス分野
  • URL: http://www.biomol.med.saga-u.ac.jp/mbg/index.htm