| 研究課題/領域番号 |
17K08727
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
土橋 洋 自治医科大学, 医学部, 准教授 (90231456)
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| 研究分担者 |
北川 雅敏 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50294971)
坪地 宏嘉 自治医科大学, 医学部, 教授 (50406055)
後藤 明輝 秋田大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (90317090)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 肺癌 / Akt / mTOR / p27 / 遺伝子増幅 / ubiquitin ligase / TFF-1 / ELISA |
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| 研究実績の概要 |
肺癌において、増殖シグナルeffctorのAktを中心とした活性化制御異常を解析した。
1. 細胞周期抑制因子p27はAkt以外にubiquitin ligase により分解制御される。93症例 (全組織型) の肺癌組織でp27とligaseの発現を免疫染色で検索した。Skp2は扁平上皮癌、小細胞癌で、Pirh2, KPCは非小細胞癌で発現が高頻度だった。臨床病理学的に腺癌でKPC発現はT因子、Pirh2はpN, pStageと、扁平上皮癌で細胞質p27はpNと有意な相関を示した。Pirh2は腺癌では予後と相関し、組織型特異的p27制御機構と、ligaseの悪性度規定因子としての有用性を示し、論文誌上発表した。
2. MLPA(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification)法のAKT1, AKT2のカスタムプローブを独自合成し、遺伝子数を定量解析した。cut-off値も独自で再設定し、腫瘍内不均一性を克服できるレベルで解析できることをFISH解析との同時解析で確認した。研究協力者の金沢大学のグループと欧米雑誌への論文執筆中である。
3. mTORに抑制される蛋白としてmicroarray 解析でTrefoil factor-1(TFF-1)を同定した。免疫染色でmTORとTFF-1は拮抗的な発現を示した。またTFF-1 promotor導入Luciferase vectorを用いた培養細胞系で、mTOR抑制剤によりTFF-1 promotor活性が亢進し、in vitro, in vivo両系でmTOR-TFF-1の制御を確認した。患者血清レベルのELISAによる定量解析系を東大・野村(連携研究者)らが確立し、我々は尿中レベルの解析系も確立した。結果、肺癌患者では血清、尿中いずれでもTFF-1が高い事を確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
1. p27のAktによるリン酸化制御とは別のubiquitin ligase による分解制御という観点から、組織型特異的なp27制御機構のみならず、ligaseの悪性度の規定因子としての有用性が示された。順調に2017年に論文誌上発表できた((Hum Pathol, 2017)。
2. MLPA法のカスタムプローブによる遺伝子数の定量解析は、世界でもまだ普及しておらず、未開の技術であったが、研究協力者である金沢大学・分子病理学講座・大井教授のグループとの連携で論文投稿へ準備が整った。
3. mTOR-TFF-1の系では、培養細胞とヒト肺癌組織の両系でmicroarray解析の結果が証明された。理科学研究所細胞銀行やATTCから購入した多種の培養細胞株では、多種の技術的アプローチ(Luciferase assay, immunoblotting, ELISA)で矛盾しないデータが得られ、順調な進捗と考えている。また、臨床病理学的アプローチとして肺癌組織、培養細胞、患者血清の解析も同時進行したが、これらでも非常に興味深いデータが得られている。
4. 予定していた研究補助員が雇用できなかったために、計画の進行は必ずしも当初に計画していたものとは異なり、臨床病理学的解析を優先に進めた。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. 前年度までにAKT1、AKT2関連miR(miR-200a)のターゲットとして肺癌組織で解析したEphA2について、培養細胞でAKT2を高発現、ノックアウトし、EphA2の動態変化に関するvalidationを行う。miR200a, EphA2のinsitu hyvridizationによる解析も共同研究者(秋田大学・後藤)と計画中である。
2. TFF-1の解析は、東大・消化器外科と共同で、患者血清と培養細胞の両面からのELISA解析と組織切片上での免疫染色を平行した解析を継続する。更に、純粋な陰性対象として健常人100例(予定)の血清、尿を文科省・学術研究支援・生命科学連携推進協議会の支援により供与されることとなり、これも加えた解析を継続する。合成TFF-1 promoter のluciferase assay はmTOR siRNA(Cell Signaling Tech. 社製を購入予定)で抑制をかけて、rapamycinによる結果のvalidationを行う。更に、TFF-1のexpression vector (CMV promotor 制御下, TaKaRa Bio.製vectorを使用予定)も合成し、肺癌培養細胞株に導入して形質変化を解析する。
3. p27とubiquitin ligaseの解析は, 既述のようにAKTの実験系で成功したMLPAのプロトコールでcustom-made probeを合成し、Skp2, KPC-1, Pirh2の3種ubiquitin ligaseの遺伝子増加との関連を解析する。probe sequenceはGene Atlasよりデザインを開始した。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
1. 前年度までの課題を1年延長し、2017年度にも研究を継続した。本課題はその内の発展であり、かつ前年度までに購入した試薬を使用できた部分があり、今年度は繰越金が生じた。これは、共同研究者も同様であり、今年度の消耗品費の使用額が少なかった。2018年度は、分子生物学的解析が主体となり、特にTFF-1のcoding sequenceのDNA合成やそのexpression vectorを用いた培養細胞への導入実験が増えるため、繰越金を使用して更なる成果をあげる計画である。
2. 予定していた研究補助者が採用できなかったため、その人件費分が消費されなかった。2018年度は研究補助者を採用したい。
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