| 研究課題/領域番号 |
17K08727
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
土橋 洋 自治医科大学, 医学部, 准教授 (90231456)
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| 研究分担者 |
北川 雅敏 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50294971)
坪地 宏嘉 自治医科大学, 医学部, 教授 (50406055)
後藤 明輝 秋田大学, 医学系研究科, 教授 (90317090)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 肺癌 / 乳癌 / Akt / mTOR / TFF-1 / 遺伝子増幅 / MLPA / FISH |
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| 研究実績の概要 |
固形癌（乳癌,肺癌）において、細胞増殖シグナルの一つであるAkt-mTOR系の活性化の制御異常をその下流分子の機能を含めて解析した。
1. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)法とdual-color fluorescence in situ hybridization analysis (FISH)法の併用により、変異の多い癌遺伝子22種を検索した結果、乳癌の34%でこれらのうちの少なくとも1種の増幅が見られ、Akt-mTOR系にも関与すると考えられるFGFR, c-MYC, cyclin D1も9.6%-12.6%で増幅を認めた。既に誌上報告した(Hum Pathol. 2019)。
2. MLPA法でAKT1, AKT2のカスタムプローブをデザイン、合成し、遺伝子数を定量解析した。cut-off値も再検討し、市販のキットやプローブが無い遺伝子に関しても、腫瘍内不均一性を克服できるレベルでスクリーニングできることをFISH解析との同時解析で報告した(論文投稿中)。
3. mTORに抑制される蛋白としてmicroarray 解析でTrefoil factor-1(TFF-1)を同定した。ヒト肺癌でmTORとTFF-1は拮抗的な発現を示し、培養系でmTORによるTFF-1 promotorの抑制をLuciferase assayで確認した。TFF-1過剰発現株での機能解析では、TFF-1により増殖能、遊走能、浸潤能のいずれもが抑制されることが明らかとなった(第108回日本病理学会発表予定)。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1. Akt周辺の癌関連蛋白は多いが、その中でもFGFR, c-MYC, Cyclin D1が乳癌において10%前後の頻度で増幅していることが明らかとなり、順調に年度内に論文発表できた((Hum Pathol, 2019)。
2. MLPA法のキットで市販化されていない遺伝子については解析が困難であったが、カスタムプローブによる遺伝子数の定量解析に成功し、研究協力者である金沢大学・分子病理学講座・大井教授のグループとの連携で論文投稿できた。
3. mTOR-TFF-1の系では、培養細胞とヒト肺癌組織の両系で解析を進めているが、本年度は主として培養系で解析が進み、癌細胞の増殖に対するTFF-1の抑制的な機能を証明するデータが得られ、順調な進捗と考えている。また、臨床病理学的アプローチとして肺癌組織、培養細胞、患者血清の解析も同時進行しているが、文科省の支援事業により研究協力機関の京都府立医大から健常者血清、尿検体を供与され、更に精密な解析に進展している
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| 今後の研究の推進方策 |
1. TFF-1のexpression vector (CMV promotor 制御下)を用いた肺癌培養細胞株での形質変化は終了したので、次に内因性TFF-1の発現をRT-PCRで、内因性、外因性TFF-1の細胞外分泌をconditioned mediumを用いてELISA解析する。
2. TFF-1,2,3の血清、尿を用いたバイオマーカーとしての有用性の解析は、東大グループと継続する。癌症例200例、純粋な陰性対象として健常人200例の血清、尿を文科省・学術研究支援・生命科学連携推進協議会の支援により京都府立医大より供与されており、これも加えた解析を継続する。また肺癌患者の術後のTFF-1～3の推移を追加解析する予定で、追加倫理申請も認可された。
3. 肺癌患者の手術検体でTFF-1～3の免疫染色による発現解析を行い、培養細胞系や患者血清、尿でのデータと比較解析する。
4. 次年度は最終年なので、上記のin vitro, in vivoのデータを総括して各々を、あるいは統合して論文発表する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
1. 基盤研究の助成を受けた2016度までの課題を1年延長し、2017年度にも研究を継続した。本課題は更にその発展であり、備蓄、購入した試薬を使用できた部分があり、今年度は繰越金が生じた。
2. 研究協力者の東大グループで、ELISAプレートを自作するなど、コストを節約できる実験系が考案され、今年度の消耗品費の使用額が少なかった。
3. 2019年度は分子生物学的解析ではRT-PCR等の発現解析や、TFF-1の転写制御に関与するmTOR下流分子の探索等、高額な試薬が必要となる実験を多々実施する予定である。また、文科省の支援による健常人検体の解析も増えるため、繰越金も使用して多数検体を解析し、更なる成果をあげる計画である。
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