研究課題
IgG4関連疾患は、血清中のIgG4の高値とともに、諸臓器にIgG4陽性の形質細胞の浸潤を伴う炎症性疾患である。 IgG4関連疾患の代表的疾患は、自己免疫性膵炎(autoimmune pancreatitis:AIP)であるが、これらIgG4 関連疾患がもたら す発癌リスクについては殆ど検討がされていない。慢性胃炎や炎症性腸疾患など多くの炎症性疾患は発癌と関与しており、その原因はメチル化異常が関与している。そこでAIPの炎症細胞浸潤が、がん関連遺伝子のDNAのメチル化異常を誘発し、発癌に関与するという仮説を立て、病理学的、分子生物学的視点から以下の実験を行い検証した。1. AIP症例の選択信州大学医学部附属病院で手術が行われAIPと診断された症例をレトロスペクティブに検索して選択した。2. AIPの発癌関連遺伝子のメチル化レベルをアレイ及びメチル化定量法で計測するがん関連遺伝子などの発癌に関与する遺伝子のプロモーター領域のメチル化異常は、遺伝子発現の不活性化もしくは活性化を引き起こし、発癌に関与するものと考えられており、炎症性疾患における発癌原因として報告がされつつある。AIPに関しては発癌に関与する遺伝子のメチル化異常はほとんど検討されていない。そこで選択されたAIP患者症例膵組織のDNAをマイクロダイセクションで抽出し、その後抽出されたDNAにbisulfite処理を行い、メチル化アレイ解析法である 、Infinium MethylationEPIC BeadChipを用いて原因候補遺伝子を確定した。さらにより正確なメチル化レベルを得るために定量的メチル化解析法である、定量Methylation Specific PCR(MSP)を用いて、原因候補遺伝子のメチル化レベルを解析した。
2: おおむね順調に進展している
AIP症例の選択に関しては信州大学医学部附属病院で手術が行われ、AIPと診断されたた症例をレトロスペクティブに検索し、試料として用いることができた。また不足分に関しては近隣協力施設から、試料を提供の協力が得られ必要数を確保できた。またAIPの発癌関連遺伝子のメチル化レベルをアレイ及びメチル化定量法で計測する事に関しては、AIPの炎症部、膵臓癌の閉塞性膵炎部、正常膵に対して、DNAをマイクロダイセクションで抽出し、その後抽出されたDNAにbisulfite処理を行い、メチル化アレイ解析法である、Infinium MethylationEPIC BeadChipを用いて原因候補遺伝子を確定した。さらにより正確なメチル化レベルを得るために定量的メチル化解析法である、定量Methylation Specific PCR(MSP)を用いて、原因候補遺伝子のメチル化レベルを解析した。メチル化アレイ解析結果からの候補遺伝子選択や、MSP法に使用する特異的プライマーの設計に関しては、研究協力者であるコロンビア大学教授のAntonia R Sepulveda先生やYao Yuan先生、愛媛大学プロテオサイエンスセンターの増本純也教授からご助言いただき、適切な候補遺伝子選択や、プライマー設計を行うことができた。今後いくつかの疾患群を加えさらに検討を加える予定であるが、当初予定していた疾患群に対しては検討が行えており、順調である。
これまでに同定された原因候補となる、がん関連遺伝子に対して、AIPの炎症部、膵臓癌の閉塞性膵炎部、正常膵、それぞれのパラフィンブロックからmRNAを抽出し、がん関連遺伝子の異常な発現の有無をRT-PCRで確認する。またがん関連遺伝子の蛋白発現の有無を、タンパクに対するモノクロナル抗体を用いて免疫染色で確認する。原因候補遺伝子によって作られるタンパク質に対する抗原が免疫染色によって確認できればメチル化による影響を目視で確認可能となる。目的のがん抑制遺伝子に対する、免疫染色用の抗体が市販されていれば、それらを用いて免疫染色を行う。市販されているがん関連遺伝子に対する免疫染色用抗体は特異性の低い場合が多いので、染色がうまくいかない場合には、独自にがん抑制遺伝子に対する抗体の作製を目指す。原因候補遺伝子によって作られるタンパク質に対する抗原が免疫染色によって確認できれば病状の把握が可能となる。研究が当初計画通りに進まないときの対応としては、当科に保存されている患者血清を用いリンパ球のメチル化レベルをメチル化特異的アレイ法や定量MSP法で原因候補遺伝子のメチル化レベルを解析する。AIPの背景に悪性リンパ腫発生の報告もあるが、リンパ球におけるメチル化に関しては未知の領域が大部分であり、リンパ球におけるメチル化解析も必要である。また免疫染色がうまくいかなかった場合に備えて、愛媛大学プロテオサイエンスセンターの増本純也教授に協力していただき、特定された遺伝子のコードするタンパク質に関して無細胞蛋白合成系により、相互作用する分子の特定と抗体を作製する技術を用いて抗体作製を行う予定である。
研究計画は順調であるが、メチル化アレイ解析のコストが低下したことと、更に次年度に追加アレイ解析を先延ばしにした事による。次年度使用額はH30年度請求額と合わせて、新たな疾患群に対しての追加メチル化アレイ解析や、MSP法による追加検証に使用する。
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