| 研究課題/領域番号 |
17K08777
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| 研究機関 | 公益財団法人微生物化学研究会 |
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研究代表者 |
坂本 修一 公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所 沼津支所, 主任研究員 (60346070)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 癌転移 / 小細胞肺癌 / 同所移植モデル |
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| 研究実績の概要 |
昨年度までの研究により、「DMS273由来の高転移性亜株で高発現している膜タンパク質」１種と、「自然転移モデルの転移巣でより高発現する膜タンパク質」１種がそれぞれ当モデルでの遠隔転移形成を促進することを明らかにしてきた。平成３０年度も「これまでに得た転移関連因子候補のin vivo評価と機能解析」を主に実施した。まず、これら２種の転移促進因子の転移促進メカニズムの解析を行った。本研究ではNK細胞の活性が高いヌードマウスを用いてきたため、NK細胞への抵抗性の増強が転移促進をもたらしている可能性を考え、２種の転移促進因子のNK細胞への抵抗性への寄与を検討した。上記の因子を強制発現あるいはノックダウンしたDMS273細胞を蛍光色素CalceinAMで標識し、ヒトNK様細胞株あるいはヌードマウスから分離しサイトカイン刺激で活性化したマウスNK細胞とインキュベートした。インキュベート後、NK細胞により傷害を受けたDMS273細胞から培地中に漏出した蛍光色素を定量した。現在のところ検討した条件下では優位な変化は見られなかった。
さらに、上記の因子のうち１種についてはDMS273細胞のノックダウン株をヌードマウスに尾静脈注入して転移能を検討し、やはり転移形成が低下することを確認した。
また、脳転移解析により適したモデルを開発するために、現在自然転移モデルに用いているDMS273以外の複数のヒト小細胞肺癌細胞株について免疫不全マウスへの異種移植での転移能を検討した。その結果、そのうちの一つの細胞株が尾静脈注入すると脳を含め全身に多くの転移巣を形成することを見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
現在のモデルでは脳転移解析には転移頻度や脳転移巣の大きさがやや不十分であるため、他のヒト小細胞肺癌細胞株を検討し、脳転移形成能が高くなりうる細胞株と宿主マウスの組み合わせを見出した。一方、予定していたshRNAライブラリーを用いたin vivo機能スクリーニングの系の立ち上げが遅れており、スクリーニングを実施できなかった。また、これまでに得た転移促進因子２種の転移への関与機構については、解析を行ったものの結論は得られていない。
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| 今後の研究の推進方策 |
最終年度である次年度では、以下の３つの実験を集中的に進める予定である。
A; 現在得ている転移促進因子２種の作用機構の解析；これまでノックダウン株や強制発現株を作成してNK細胞やサイトカインに対する応答、あるいは細胞外基質タンパク質への結合能などを検討したが、顕著な変化は認められなかった。
そこで次年度は、上記因子の欠失変異体を作成してDMS273細胞に発現させ、転移能への影響を検討する。転移能に重要な部位が見つかった場合には、その部位に結合するタンパク質を探索する。
B; shRNAライブラリーによる機能的スクリーニング；高転移性亜株にCellecta社製shRNAライブラリーレンチウイルスを感染させ、選択培地中で20代程度継代し、in vitroでの細胞増殖を抑制するshRNAを排除した細胞集団（A）を作成する。それをヌードマウスの脳実質に移植し、形成された脳腫瘍巣と(A)から各々RNAを回収し、含まれるshRNA配列を次世代シーケンサーで解析する。この実験により、脳転移形成の最終過程である脳への生着に重要な遺伝子を同定する。
C; 新たな脳転移モデルの開発；昨年度見出した、免疫不全マウスにおいて著しい転移能を示したヒト小細胞肺癌細胞株について、in vivo選択法によって、より脳に転移しやすい株の樹立を試みる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
「shRNAライブラリーによる機能的スクリーニング」を計画通り実行できなかったため、shRNAライブラリーの次世代シーケンサー解析のための外注費用が残った。来年度において次世代シーケンサー解析外注費用として使用する予定である。
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