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2017 年度 実施状況報告書

自閉症原因遺伝子NLGN4Xの発現変化に起因する分子病態の解析

研究課題

研究課題/領域番号 17K08778
研究機関愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所

研究代表者

飯尾 明生  愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 発生障害学部, 客員研究者 (80344349)

研究分担者 松木 亨  愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 発生障害学部, 主任研究員 (90332329)
上田 昌史  愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 発生障害学部, リサーチレジデント (90791541)
研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2021-03-31
キーワードNLGN4X / 自閉症 / エピジェネティックス / MeCP2 / iPSC / CpGメチル化 / AVP / 逆鎖NLGN4X
研究実績の概要

本研究は、ヒト自閉症原因遺伝子ニューロリギン4X(NLGN4X)について、自閉症での遺伝子発現の変化の有無、その発現の増減を引き起こす非遺伝的背景(エピジェネティックス、環境要因)とそれによって引き起こされる分子病態を明らかにし、自閉症発症のメカニズムの解明や、発現量を指標とした新規診断法、及び発現調節を標的にした治療法の確立とQOLの改善を目的としている。本年度は平成28年度基盤研究C「自閉症高感受性遺伝子ニューロリギン4Xのエピジェネティックな発現制御機構の解析」に引き続きメチル化を主体としたエピジェネティックな発現制御機構の解明と、NLGN4Xを介したホルモン分泌制御機構の解析を行った。まず、NLGN4Xの発現が抑制されている細胞でのユビキタスな発現抑制メカニズムを調べるため、HeLa細胞の他にHepG2細胞のプロモーターCpGメチル化を検討したところ、CGIプロモーター領域はHeLa細胞程ではないが広くメチル化されているのに対し、コアプロモーターはメチル化が弱く発現抑制についてメチル化以外の要因が考えられた。また、逆鎖NLGN4X RNAの発現制御プロモーターの同定のため、転写開始点から上流2kb, 下流3kbをレポーターベクターにつなぎレポーターアッセイしたところ、非常に低い活性しか検出できなかったため、コアプロモーターの同定に至らなかった。次にNLGN4XのリガンドNRXN2βの作用によるAVP分泌量の変化を調べたところ、可溶性NRXN2βでは影響が見られなかったため、膜型NRXN2βに変更して解析する予定である。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

前回と同様、コアプロモーター領域のCpGメチル化解析が難航し時間を要してしまった。また、可溶性NRXN2βによるAVP分泌変化の解析がうまくいかず、膜型、クラスタリング活性の付与など検討する必要が生じた。逆鎖NLGN4Xのプロモーター活性が低く、コア領域の特定に至っていない。

今後の研究の推進方策

30年度は引き続きプロモーターのCpGメチル化解析をNLGN4X発現細胞/ NLGN4X非発現細胞で継続し、発現抑制、発現促進におけるユビキタスなメチル化プロファイルを明らかにするとともに、CRISPR-CAS9システムを用いたジーンドライブにより、NLGN4X非発現細胞でのNLGN4X発現活性化、NLGN4X発現細胞での発現不活性化を人為的にコントロールし、神経突起の形状、ホルモン分泌、シナプス活動などの表現型にどのような影響がみられるか検討する。また、Sp1,CEBPsなどMeCP2以外の転写制御因子によるプロモーターのChIP解析を行い、クロマチンレベルでの発現制御プロファイルを明らかにする。一方、NRXN2βを膜に発現するHEK293細胞との共培養によりAVP発現に変化が見られないか検討するとともに、グルカゴン産生細胞、NK細胞でのNLGN4Xの発現の確認、アドレナリン産生クロム親和性細胞でのNLGN4Xの発現の確認とアドレナリン産生への影響の有無を検討する。

次年度使用額が生じた理由

コアプロモーターのCpGメチル化解析が難航し、可溶性NRXN2βによるAVP分泌制御の解析が不調に終わり、逆鎖NLGN4X-RNAのプロモーター解析が進展しなかったため、その後のChIP解析、ジーンドライブの準備が遅延した。本年度は前年度行う予定であった当研究を繰り越して実施するため、当該年度予算にそのまま繰り越して使用する予定である。

  • 研究成果

    (3件)

すべて 2017 その他

すべて 学会発表 (2件) 備考 (1件)

  • [学会発表] Stk25欠損マウスの発達において発達においてMST3が果たす代償的役割2017

    • 著者名/発表者名
      松木亨、飯尾明生、中山敦雄
    • 学会等名
      日本組織培養学会第90回大会
  • [学会発表] Stk25 and MST3 act on neuronal polarization, migration, and cardiovascular development2017

    • 著者名/発表者名
      松木亨、飯尾明生、上田昌史、戸谷明恵、中山敦雄
    • 学会等名
      平成29年度「先端モデル動物支援」成果発表会
  • [備考] 愛知県心身障害者コロニー 発達障害研究所 発生障害学部

    • URL

      http://www.inst-hsc.jp/d-embryology/index.html

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公開日: 2018-12-17  

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