| 研究課題/領域番号 |
17K08782
|
|---|
| 研究機関 | 群馬大学 |
|---|
研究代表者 |
瀬戸 絵理 群馬大学, 大学院医学系研究科, 助教 (40431382)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | 感染応答 / mRNP / P-body / Trypanosoma cruzi |
|---|
| 研究実績の概要 |
Processing body (P-body)は真核生物における細胞質mRNP（mRNA-蛋白質複合体）顆粒のひとつで、mRNAの分解や翻訳抑制を担う。P-bodyは定常状態の細胞にも存在しているが、ストレス刺激などの環境の変化でさらに形成が誘導される。そしてそこにはポリソームを離れたmRNAと翻訳不活化を担う蛋白質との複合体がリクルートされてくる。寄生虫感染の初期には、自然免疫応答として宿主のストレス応答関連蛋白質やサイトカインなどの翻訳調節が迅速かつ的確に行われていると考えられるが、その制御機構については不明な点が多い。これまでの研究で、偏性細胞内寄生原虫Trypanosoma cruzi (T.cruzi)のin vitro感染でP-bodyの形成が誘導されることを見出だした。またsiRNAによってP-bodyをノックダウンした細胞では、T. cruzi の侵入および増殖が亢進した。この結果から、感染で誘導されるP-bodyでT. cruziの侵入や増殖に対して防御的に機能する蛋白質の翻訳が調節されている可能性を考えた。そこで、P-bodyの形成抑制によって感染初期の宿主mRNAの翻訳がどう変化するかを調べるため、CRISPR/Cas9システムを用いたP-bodyノックアウト細胞の樹立を試みた。また、感染によってP-bodyにリクルートされてくる宿主mRNAの同定を目的とし、タグを付加したP-body構成蛋白質を安定に発現する細胞株を樹立した。タグに対する抗体で免疫沈降し、ウェスタンブロッティングを行ったところ、他の複数のP-body構成蛋白質の共沈を確認できた。この結果から、本法によりP-bodyを分画精製できたと考えられる。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成29年度はCRISPR/Cas9ゲノム編集システムを用いて、P-body形成に必須な蛋白質をノックアウトした細胞株を樹立し、感染後の時間経過に伴ったストレス応答関連蛋白質やサイトカインの産生量やパターンの変化を調べる予定であった。2種類のターゲット蛋白質に対するsgRNAを合成し、Cas9蛋白質とともにT. cruziの感染許容細胞であるHT1080細胞への導入を行ったが、ノックアウト株の樹立には未だ至っていないことから、研究は当初の計画より遅れていると考えられる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
P-bodyノックアウトHT1080細胞株の樹立が困難な理由として、この細胞に対するCas9蛋白質の導入効率が低い可能性が考えられた。そのため、mRNAでのCas9の導入を試みる。また、より切断活性の高いsgRNAの設計も検討する。さらに、他のT. cruzi感染許容細胞でのP-bodyノックダウン細胞株の樹立も試みる。タグを付加したP-body構成蛋白質発現細胞を樹立できたので、感染細胞と非感染細胞からP-bodyの免疫沈降を行う。沈降サンプルからcDNAライブラリ調整を行い、次世代シーケンシングやマイクロアレイによって比較解析する。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
P-bodyノックアウト細胞の樹立に想定以上の時間を要しているため、未使用額が生じた。平成30年度の経費の主な用途は消耗品である。その内訳は細胞培養に必要な培地、血清、デイッシュなどのプラスチック製品、ガラス器具、抗体、オリゴ作製費、試薬類である。また国内学会で研究成果を発表するために必要な旅費も使用予定である。
|
