病原細菌がハイジャックするユビキチン修飾システム

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K08786
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: Kim Minsoo 京都大学, 白眉センター, 特定准教授 (50466835)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 細菌感染 / ユビキチン / エフェクター

研究実績の概要

蛋白質のユビキチン修飾系は発生や免疫系、さらには、がん・神経変性疾患など様々な生理機能や疾患に関与することがよく理解されている。しかし、本修飾系の細菌感染における意義は未解明である。本研究では、申請者が独自に解析を進めている２つの病原因子を起点に、構造生物学・生化学や感染病理学などの手法により、病原細菌の感染成立におけるユビキチン修飾系の役割解明を目指す。申請者が発見した新規エフェクター X は in vitroでユビキチンリガーゼ (E3) 活性を示すが、既知のE3とは相同性が無い。そこで、立体構造解析及び生化学アッセイ系を用いて機能解析を行った。
(a) エフェクター Xのユビキチンリガーゼ活性を担う立体構造：エフェクター X全長の大腸菌発現系及び精製系を構築した。得られた精製蛋白質を用いて、エフェクター単独での結晶化を試みたが、結晶化には至らなかった。全長での解析に難しいと判断し、部分断片の蛋白質を発現する系をいくつか作製し、精製条件の検討を行っている。立体構造が明らかになるとリガーゼ活性に必須のアミノ酸残基が決定できると期待される。
(b) エフェクター Xのリガーゼ活性の特異性：既述の通り、申請者はX にin vitroでのユビキチン化活性を証明している。しかし、Xと協役するユビキチン連結酵素 (E2)の特異性や形成されるポリユビキチン鎖の実体は不明であった。精製したE2蛋白質(10種類)を用いて、in vitroユビキチン化反応を行い、Xと協役するユビキチン連結酵素を同定した。同定したE2酵素を用いて、ユビキチン鎖の重合様式を調べた。その結果、48番目のリジン残基を介するポリユビキチン鎖を作るユビキチンリガーゼであることが明らかになった。この結果が、エフェクター Xが基質蛋白質を分解することで、感染に寄与すると考えられる。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

生化学解析によりエフェクターの酵素活性を測定することができ、前年度の計画通りにおおむね順調に解析が進んでいる。

今後の研究の推進方策

前年度に得られた成果と諸処の状況を検討する。その上で、以下の点と前年度に未了の課題がある場合にはその課題について優先事項を決定し、研究を推進する。
(c) エフェクター Xの標的基質となる宿主蛋白質： X を強制発現させた培養細胞からXと結合する宿主蛋白質を精製し、質量分析で同定することで、Xがユビキチン化する基質の候補を得る。得られた候補について、エフェクター Xとの共発現によるユビキチン化、また、 EPEC感染によるX依存的なユビキチン化を検証する。
(d) エフェクター Xによる標的基質の認識機構：エフェクター Xが上記 (c)で同定された標的基質を認識（結合）する機構を明らかにするために、両者の結合に必要なX及び当該基質の領域を同定する。さらに、立体構造解析が可能な両者の複合体を得て、その X-線結晶解析により、結合の分子基盤を解明する。

次年度使用額が生じた理由

基質を同定するために質量分析を行う予定である。今年度はその条件検討を行った。次年度は設定した条件に従って基質同定を実施する予定である。そのためには、大量の細胞培養試薬及び培地などが必要であり、次年度に購入を計画している。