| 研究課題/領域番号 |
17K08814
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| 研究機関 | 神戸常盤大学 |
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研究代表者 |
鈴木 高史 神戸常盤大学, 保健科学部, 教授 (70305530)
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| 研究分担者 |
川田 均 長崎大学, 熱帯医学研究所, 准教授 (80363480)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ナトリウムチャンネル / Aedes / Crispr/Cas9 |
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| 研究実績の概要 |
平成30年度は、過去にピレスロイド剤の使用報告があるが、電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子のkdr変異の調査がほとんどされていない地域として、ネパールのポカラを選択した。シマカ (Aedes)採集は主に市街地の道路沿いに点在する放置タイヤに発生する幼生の採集により行った。採集地点数は13箇所であった。採集した幼虫にd-アレスリンを用いた簡易的な殺虫試験を行い、ピレスロイド感受性の高低を判断した。幼虫は個体別にアルコールに漬けて持ち帰り、外部形態による同定を行った後にDNAを抽出してダイレクトシーケンス解析を行い、電位依存性ナトリウムチャンネルの変異解析を行った。その結果、以下のことが明らかになった。
1. 形態学的解析の結果、殺虫剤抵抗性解析に用いたものの78％がネッタイシマカ、22%がヒトスジシマカであった。
2. ネッタイシマカはピレスロイド抵抗性を示す傾向を示した。ヒトスジシマカは感受性が高かった。
3. ネッタイシマカの電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子にV1016G、F1534C、S989Pの変異が見つかった。頻度は、V1016Gが最も高かった。
電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子のHEK293培養細胞への導入プロトコールに関しては、昨年度までに既に確立してきたが、導入後チャネルのプロファイル測定を安定して行うことができなかった。そこで、平成30年度は電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子のβサブユニットをαサブユニットと同時に発現するコンストラクトの作製を行った。そのコントラクトを用いて、HEK293培養細胞に導入した結果、安定してプロファイル測定を行うことが可能となった。しかし、その電流量が阻害剤アッセイを行うためには不十分であった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子をHEK293培養細胞へ導入するプロトコールの改良を行い、電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子のβサブユニットをαサブユニットと同時に発現するコンストラクトの作製を行った。そのコントラクトを用いて、HEK293培養細胞に導入した結果、安定してプロファイル測定を行うことが可能となった。しかし、この細胞を用いて、阻害剤アッセイやスクリーニングを行うためには電流量が不十分であり、さらに改良する必要が明らかになったため。
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| 今後の研究の推進方策 |
電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子のβサブユニットをαサブユニットと同時に発現させることにより、安定してチャネルのプロファイル測定を行うことが可能となった。しかし、この細胞を用いて、阻害剤アッセイやスクリーニングを行うためには電流量が不十分であるという課題が残った。そこで、本課題の解決のために、細胞の培養条件の詳細な検討を行う。また、導入するαサブユニット遺伝子にはvariantが多数見られるため、導入遺伝子を変更する。これらにより課題の解決を行い、研究を推進していく予定である。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
電位依存性ナトリウムチャンネル遺伝子の培養細胞への導入プロトコールの再検討が必要となり、引き続いての阻害剤解析やスクリーニング解析を行えなかったため、当該用途の使用額が未使用となったため。
当初の実験計画に従い、未使用額は次年度に阻害剤解析やスクリーニング解析を行うために用いる。
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