| 研究課題/領域番号 |
17K08817
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| 研究機関 | 国立研究開発法人国立国際医療研究センター |
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研究代表者 |
安田 加奈子 (駒木加奈子) 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, 研究所 熱帯医学・マラリア研究部, 研究員 (50415551)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | マラリア原虫 / 転写因子 / RNA結合ドメイン / KHドメイン |
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| 研究実績の概要 |
PREBPを含む4つのKH因子群遺伝子のC末相当部分の配列の一部とGFP遺伝子の配列を連結し、熱帯熱マラリア原虫で汎用されている、遺伝子導入用プラスミドベクターpHC1に挿入した。これを培養熱帯熱マラリア原虫にエレクトロポレーションによって導入し、ピリメタミンによって遺伝子導入原虫のセレクションをおこなう。pHC1に導入された原虫遺伝子配列は比較的容易にゲノム上の同配列と相同組換えを起こすことが、申請者によるこれまでの実験によって明らかになっていたが、予想通り、全ての因子の遺伝子についてPCRによって相同組換えが起きたことを確認できた。それぞれの遺伝子導入株を限界希釈によって、クローン化した。この様にして得られた、遺伝子改変原虫株では、各因子のC末にGFPがフュージョンされた状態で、染色体上のそれぞれの因子が元来保有しているプロモーターによる制御化において、適切な時期、適切な発現量で発現することが予測できる。予測通り、全ての因子について、本来の遺伝子のC末にGFPがフュージョンしている状態で発現していることをRT-PCRによって確認した。また、細胞が、GFPによる蛍光を発していることを共焦点顕微鏡による観察で確認した。PREBP-GFPフュージョン発現株については、PREBP-GFPによる蛍光がリング期には細胞質に観察されるが、トロホゾイトー初期シゾント期には核に局在して観察されることを確認した。リング期、後期シゾント期には、PREBP-GFPによる蛍光は細胞質に局在し、核には存在しなかった。これは、今までに核抽出画分、細胞質画分を用いておこなった免疫沈降-ウエスタンブロットの結果と一致するものである。また、PREBP-GFPが核に局在していた時期はPREBPがその発現を制御している遺伝子pf1-cys-prxの発現が亢進される時期と一致していることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の遂行には、PREBPを含む4つのKH因子群遺伝子にGFPをフュージョンさせた状態で、遺伝子本来のプロモーターの支配下に発現させた培養熱帯熱マラリア原虫株を作ることが全ての出発点となり、ここで、何らかの理由によって上手くいかないと全ての研究計画が遂行不可能となってしまう。この、最大の難関を全ての因子について初年度で突破することができたので、おおむね研究計画は順調に進展していると判断した。研究計画で初年度に計画していた、全ての因子についての共焦点レーザー顕微鏡によるGFPの局在観察、また抗GFP抗体を用いたクロマチン免疫沈降は、ここまでの準備が出来れば速やかに進めることができると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
GFPタグ付きの転写因子の核局在が原虫の発育ステージに伴ってどの様に変化しているのかを引き続き観察する。局在が変化している場合には、転写因子に何らかの修飾がされているのか、抗GFP抗体を用いた免疫沈降によって原虫細胞より転写因子を精製し、各種修飾アミノ酸、あるいはユビキチンに対する抗体を使用したウエスタンブロットにより解析する。これらの転写因子群が核に局在している時期に、どの遺伝子の5’に結合しているのかを網羅的ChIP-Seq解析によって明らかにする。 これらの5’の配列について蓄積された情報をバイオインフォマティクスにより解析し、各転写因子の結合モチーフを明らかにする。 ゲルシフトアッセイによって、因子のKHドメインが認識して結合するcis-element DNAの状態が一本鎖か二本鎖かを明らかにする。まMNase assayによりKH因子群のターゲットのヌクレオソーム動態を観察する。各KH因子と共同して働くことが予測される、GCN5、SWI/SNF, FIRホモログ、TFIIHなどの因子群の抗体を用いた免疫沈降―ウエスタンブロットにより、これらとKH因子群の複合体形成の有無、また、そのタイミングを検証する。
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