| 研究課題/領域番号 |
17K08824
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| 研究機関 | 岐阜大学 |
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研究代表者 |
後藤 隆次 岐阜大学, 研究推進・社会連携機構, 助教 (80326355)
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| 研究分担者 |
田中 香お里 岐阜大学, 研究推進・社会連携機構, 教授 (20242729)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 嫌気性菌 / Bacteroides fragilis / 薬剤耐性機構 / カルバペネム耐性菌 / 全ゲノム解析 / β-lactamase |
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| 研究実績の概要 |
2017 年度に我々は、カルバペネム中等度耐性 Bacteroides fragilis GAI92214 株の全ゲノム配列を決定し、当該耐性に寄与する可能性のある class D β-lactamase を見出した。2018 年度には、本酵素遺伝子領域 （promoter 保有 ・ 非保有の 2 通り） を E. coli 用ベクター pHSG398 へ挿入し、得られた E. coli 組換え体の Ampicillin と Meropenem の MIC 値を測定したところ、Ampicillin は陰性コントロールと比べ有意差 （64 倍） が認められたが、Meropenem では差が認められなかった。2019 年度は、E. coli - Bacteroides シャトルベクターを用いて、上述 2 通りの酵素領域を E. coli ならびに B. fragilis NCTC 9343 株へ導入し、本酵素の B. fragilis 内での機能解析に着手した。酵素 promoter 保有 class D β-lactamase plasmid （lacZ と順向き挿入） は、 E. coli へ導入できたが、B. fragilis へは導入できなかった。同領域を逆向き挿入したところ、両菌種へ導入できた。promoter 非保有酵素は、挿入方向にかかわらず両菌種へ導入できた。promoter 非保有酵素が導入された B. fragilis NCTC 9343 株組換え体について、Meropenem と Imipenem の MIC 値を測定したが、陰性コントロールと比べて有意差は認められず、本酵素活性には上流 promoter が必須の可能性がある。現在、promoter を保有する B. fragilis 酵素組換え体について、同 MIC 値を測定中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
class D β‐lactamase 組換え大腸菌が有意なカルバペネム分解活性を示さず、元菌種内でのみ活性を示した報告例が、B. fragilis 以外の他菌種にて報告がある事から、我々は大腸菌‐Bacteroides 属間シャトルベクター pNLY1 を入手し、本酵素を B. fragilis 内で機能解析する研究に着手した。2019 年度は 2 種のサイズ縮小化ベクター （pNLY1Δampr と pNLY1ΔamprΔmob） へ次の 4 通りの断片を挿入した： （1） promoter 保有 - class D β-lactamase （lacZ と順向き挿入） （2） promoter 非保有 - class D β-lactamase（順向き） （3） promoter 保有 - class D β-lactamase （逆向き） （4） promoter 非保有 - class D β-lactamase （逆向き）。次に、各組換えプラスミドを E. coli 4 株 [KAM3 ΔtolC、HST08 （endA－/recA－）、HB101 （endA－）、HST04 （dam－/dcm－）] および B. fragilis NCTC 9343 株への導入を試みた。E. coli 4 株 （一部、未実施） へは、上記 （1）～（4） の何れの組換えプラスミドを導入できた。B. fragilis へは、上記 （1） を導入できなかったが （大量発現酵素の細胞毒性、DNA - タンパク質間結合障害等の可能性あり）、（2）～（4） を導入できた。2019 年度は上記 （1）、（2） の段階にて、エレクトロポレーションによる導入実験条件 （菌増殖期、培養温度、菌洗浄 Buffer、DNA 量等） を複数試行する必要が生じたため、研究成果にやや遅れが生じた。
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| 今後の研究の推進方策 |
（1） 当該 class D β-lactamase の基質特異性等の機能解析を行うために、得られた組換え体を用いた各種薬剤感受性試験を行う。当該酵素がカルバペネム耐性に寄与している場合、当該遺伝子破壊株を用いた検証試験や、当該組換え酵素の精製・性状解析に着手する。
（2） 当該酵素の遺伝子発現解析だけでなく、RNA-Seq による網羅的発現解析を行う。
（3）（2） にて、当該酵素以外にカルバペネム耐性に寄与する因子が推定された場合、これまでに構築したシャトルベクター実験系、薬剤感受性試験実験系等を利用して、同様に機能解析を行う。
（4） 2020 年度は本研究課題期間の最終年度であり、国内外での成果報告（学会・論文）を更に推進させる。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
（理由）
当該 class D β-lactamase は、大腸菌内にてアンピシリン分解活性を検出できたが、カルバペネム系薬分解活性を明確に検出できなかったため、昨年度よりシャトルベクターを用いた B. fragilis 内での機能解析に取り組んできた。2019 年度は、当該酵素の promoter の有無、挿入断片の方向、大腸菌宿主内での修飾（メチル化等）の有無、エレクトロポレーション諸条件等、組換えシャトルベクターを導入する最適条件の探索に大幅な時間を要した。概ね、最適条件は見出せたが、当初に計画していた各種薬剤感受性試験、遺伝子発現解析、他因子の網羅的検討等の取り組みは遅れている。これら着手できなかった研究に要する消耗品費・受託解析費等を繰り越す必要が生じたため、次年度使用額が生じた。
（使用計画）
研究がやや遅れたことと、次年度使用額が生じたこと等を考慮し、研究効率化のためにも RNA-Seq 等については、外部へ委託解析する予定である。その他、成果報告の効率化に向けて、特にバイオインフォマティクス関連で利用可能な外部委託や共同研究等の推進も検討中である。
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