| 研究課題/領域番号 |
17K08842
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| 研究機関 | 法政大学 |
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研究代表者 |
西山 宗一郎 法政大学, マイクロ・ナノテクノロジー研究センター, 研究員 (30343651)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | コレラ菌 / 走化性 / 環境応答 / 病原因子 / 遺伝子発現制御 |
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| 研究実績の概要 |
コレラ菌は胆汁成分のタウリンに走化性を示し，その走性は30℃培養時に比して37℃培養時に上昇する．受容体であるMlp37は培養温度依存的に制御を受ける．一方，コレラ菌は温度やpHなど外環境に応じ，病原因子の発現を調節するToxR/TcpP制御ネットワークをもつ．本研究では走化性受容体Mlp37及び類縁のMlp24がToxR/TcpPの制御下にあるのか，もしそうなら具体的にどのようなメカニズムで制御されるのかを解明することが目的の1つ（テーマ1）である．もう1つの目的は，その遺伝子がpathogenicity islandに位置し，ToxR/TcpPの関与が強く疑われる一方で解析が進んでいない走化性受容体Mlp7, Mlp8，及びMlp8の結合タンパク質と目されるAcfCの機能を明らかにすることである（テーマ2）．平成29年度は以下のように研究を進めた．
テーマ1：Mlp37の温度依存性についてプロモーターアッセイを行い，その制御が転写開始レベルで行われることを見出した．またtoxRやtcpPの欠失株では30℃培養時の抑制が外れることが明らかになった．すなわちそれぞれの欠失株において，タウリン走性は30℃培養時でも37℃に匹敵する強さであった．ノーザンブロッティングやプロモーターアッセイの結果もこれを裏付けるものであった．以上の結果はMlp37が実際にToxR/TcpPネットワークにより制御されていることを強く示唆する．また付随してToxR/TcpPの下流にある転写因子であるToxTのペプチド抗体を得た．
テーマ2：Mlp7及びMlp8について，プロモーターアッセイ用のプラスミドを新たに構築し，培養温度依存性を調べた．その結果，これらの受容体についてもその遺伝子の発現制御が培養温度依存的であるが，その傾向はmlp37と逆方向，すなわち温度が低いときに発現が上昇すること，また少なくとも部分的には転写開始レベルで制御されていることが示された．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
おおむね平成29年度の研究実施計画通りに解析が進んだため．
タウリン走性受容体Mlp37については，その温度依存的な発現が転写開始レベルでの制御であること，また実際にToxR/TcpPネットワークの制御下にあること，即ちmlp37遺伝子がToxRレギュロンに含まれている可能性を強く示唆する結果を得た．ToxR/TcpPネットワークを構成する関連因子の遺伝子欠失株を用いて引き続き研究を進め，制御ネットワークのどこにmlp37が位置するのかを探る．Mlp7及びMlp8についてはMlp37とは逆方向の温度依存性を示すことが明らかになった．同じ制御ネットワークでmlp37とmlp7/mlp8が正反対の調節を受けるメカニズムを探ると共に，Mlp7及びMlp8の機能解析を行っていく．
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| 今後の研究の推進方策 |
現在ToxR/TcpPの下流にある転写因子であるToxTの遺伝子欠失株を作製中であり，作出次第タウリン走性の温度依存性を解析する．温度依存性が消失すれば，mlp37はToxR/TcpPで直接制御を受けるのではなく，ToxT以降の下流因子が関与する可能性が大きい．また同じ欠失株を用いてmlp37のプロモーターアッセイも行う．
Mlp7, Mlp8-AcfCについては当該遺伝子のcloningはすでに完了しているので，これを用いまずは解析が容易な大腸菌再構成系を用いてそのリガンドを探索する．リガンド候補が見つかればコレラ菌を用いたダイレクトな機能解析を行う．またToxR/TcpP/ToxTの遺伝子欠失株を用いたmlp7, mlp8のプロモーターアッセイも計画している．先述のToxTペプチド抗体については，まずその有効性をWestern blottingでチェックし，有効であればToxT発現のモニタリング等に用いる．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
研究は概ね計画通り順調に進展しているが，遺伝子組換えによる欠失株の作製に僅かな遅れが生じているため，次年度使用額が生じた．
次年度使用額の使用計画
遺伝子組換えによる欠失株の作製の完了のため，遺伝子組換え及びその確認に必要な消耗品への使用を計画している．
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