| 研究課題/領域番号 |
17K08849
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
森田 英嗣 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (70344653)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | フラビウイルス / VCP |
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| 研究実績の概要 |
フラビウイルスの感染細胞内に形成される特殊なオルガネラ：ウイルス複製オルガネラに感染特異的にリクルートされる宿主因子のスクリーニングによって同定されたVCP/p97複合体について、フラビウイルスである日本脳炎ウイルス(JEV)とデングウイルス感染系を用いてウイルス増殖における役割と機能について解析を行った。本年度は主に、VCPが関与する小胞体関連分解(ER-associated degradation ERAD)のウイルス増殖における役割について解析した。ERAD因子であるDerlin1、Derlin2、Derlin3、Sel1Lのノックアウト細胞でのウイルス増殖能を検討したところ、Derlin-1欠損細胞ではJEV増殖能は野生型細胞とほぼ同等であったが、Derlin-2、Derlin-2/3、Sel1L欠損細胞でJEVの増殖が著しく減弱していた。また、ERAD因子群の感染細胞内局在について調べたところ、Derlin-2は複製オルガネラのconvoluted膜と呼ばれる領域に局在していることを明らかにした。さらに、各種ウイルス因子の分解速度についてCycloheximideチェイス実験により検討したところ、NS4Bなど一部の膜アンカー型非構造タンパク質のみが選択的にERADによって分解されていることが確認された。これらの結果は、convoluted膜は膜アンカー型ウイルス非構造タンパク質のDerlin-2/3依存的なERAD機構による分解の場であり、分解による各ウイルス因子の量の調節が、ウイルスが効率よく複製するうえで必須であることを示唆している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
網羅的なオルガネラのプロテオミクス解析によって同定されたWedge (くさび) 型因子群がフラビウイルス複製オルガネラ形成及びウイルスの増殖に関与するか、各種因子の局在変化や、日本脳炎ウイルスやデングウイルス感染に対するWedge型因子変異体発現の影響、遺伝子破壊細胞の作成と遺伝子欠損の影響などを調べ、その分子機構を明らかにし、創薬の標的となりうる分子間相互作用の生化学的特徴を明らかにするというのが、H30年度にかけての計画である。これまでに、フラビウイルスの増殖に必要なWedge型因子の同定や、感染細胞内におけるこれら因子の挙動を明らかにしている。まだ、感染に伴うどのような現象がきっかけでWedge型因子がウイルス複製オルガネラにリクルートされるのか、その分子機構は明らかになっていないが、おおむね研究計画通り順調に進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後、研究計画どおり、ウイルス増殖に必須なウイルス因子-宿主因子間、または宿主因子間同士の物理的相互作用に着目し、それぞれの蛋白質因子に対して各種末端欠損変異体を作製し結合領域を特定する。また、大腸菌発現系を用いて結合部位を含む組み換え蛋白質を作製し精製を行う。それぞれの蛋白質-蛋白質相互作用の結合力価を測定するなど、物理的相互作用の生化学的解析を行う。
さらに、プロテオーム解析で明らかにした他の因子に着目して解析を進める。特に、宿主因子の強発現によるウイルス増殖に対するドミナントネガティブ効果を示す因子の検索を行う。これによって、siRNAによるノックダウンやゲノム編集によるノックアウトによるloss of functionによるスクリーニングでは発見できない因子を同定することができると期待される。
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