| 研究課題/領域番号 |
17K08864
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| 研究機関 | 和歌山県立医科大学 |
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研究代表者 |
西尾 真智子 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (70156040)
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| 研究分担者 |
松本 祐介 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (00735912)
太田 圭介 和歌山県立医科大学, 医学部, 助教 (90625071)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ハザラウイルス / N蛋白 / クリミア・コンゴ出血熱ウイルス / ミニゲノム系 |
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| 研究実績の概要 |
致死性の高い人獣共通感染症の１つであるクリミア・コンゴ出血熱ウイルス(CCHFV)の研究を進めるため、ヒトに病気を起こさずBSL2で扱える極めて近縁のハザラウイルス(HAZV)をモデルとして選んだ。大腸菌でN蛋白を発現させ、精製し、それを抗原とし作製したモノクローナル抗体を使い、細胞でのHAZV増殖、感染細胞内でのウイルス蛋白の分布等を検討した。また、N蛋白が細胞傷害性を抑制している事を示唆する結果を得た。これらの結果は学会発表を行い、論文としてまとめた。
ミニゲノム系の作製に関してはミニゲノムおよびN蛋白およびCCHFVのL蛋白と同様にL遺伝子のコドンを最適化したL蛋白を発現するヘルパープラスミドを作製した。これらのヘルパープラスミドを使用して、ミニゲノムのルシフェラーゼ活性を測定することができ、ミニゲノム系が完成した。完成したミニゲノム系を駆使し、プロモーター領域に重要な配列がある事を明らかにすることができた。この成果も学会発表およびに論文作製した。
ミニゲノム系の作製に成功したので、リバースジェネティック系の作製に取り掛かった。３分節のゲノムクローニングをし、ベクターに組み込んだが、現時点ではレコンビナントウイルスの作製には成功していない。計画通り出来なかった原因を探るためにも、N蛋白以外のウイルス蛋白を検出するためのモノクローナル抗体が必要である。その為、前回違った方法、感染細胞を抗原として使用する方法で、新たにモノクローナル抗体作成に取り掛かっている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ミニゲノムの系の確立に成功し、プロモーター領域にウイルスの転写・複製に重要な配列があることを明らかにする事が出来た。またN蛋白対するモノクローナル抗体が使えるようになったので、感染細胞でのN蛋白を可視化できるようになり、N蛋白にアポトーシスを阻害する機能があることを明らかにする事が出来た。これらの点において、計画以上の成果を挙げているように思う。しかし、３分節の全長ゲノムはベクターに組み込んだが、現時点ではレコンビナントウイルスの作製には成功していない。この点に関しては、計画通りとは言えない。しかしながら、この遅れも解決するためにすでに動き出しており、31年度中には達成出来ると考えている。
以上、総合すると全体としては概ね順調に進展していると言える。
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| 今後の研究の推進方策 |
N蛋白に対するモノクローナル抗体とミニゲノム系は構築できたので、まずこれを使ってN蛋白に変異を導入し、機能に重要なドメインの検討を行う。
HAZVのリバースジェネティック系を確立し、リコンビナントウイルスの作製につなげる。ミニゲノムの系で明らかになった機能に重要な領域に変異を入れた人工ウイルスを作製し、ウイルスの機能を検討していく。また既に確立した発育鶏卵を利用した病原性の評価も実施する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度出た研究成果の論文の別刷り代は立替払いであるため、使用額に上がっていない。また、恒温振とう器を購入予定であったが、共通で使える機器の存在により、購入を見合わせたため、当初の計画通り使用されていない。
また、本年度はリバースジェネティック系の構築が予定通り、確立できなかったため、消耗品の使用量が予定より少なかった。しかし、次年度は論文掲載料、別刷り代、試薬等の消耗品の費用が増加することが明らかであるため、当該助成金と次年度の助成金を合わせて使用する計画である。
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