| 研究課題/領域番号 |
17K08872
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| 研究機関 | 独立行政法人国立病院機構(名古屋医療センター臨床研究センター) |
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研究代表者 |
大出 裕高 独立行政法人国立病院機構(名古屋医療センター臨床研究センター), その他部局等, 研究員 (20754162)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | タンパク質複合体構造予測 / ドッキングシミュレーション / APOBEC3G / HIV-1 / Vif / タンパク質-タンパク質相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
ヒトゲノムには、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)の複製を阻害できる能力をもつタンパク質が複数コードされている。そのひとつがヒトAPOBEC3G (hA3G)である。しかし、HIV-1がコードするVifタンパク質によってhA3Gの分解が促進され、hA3Gがもつ抗HIV-1作用は阻害されてしまう。Vifによる阻害はhA3Gとの相互作用に起因し、hA3G-Vif間結合に重要なアミノ酸残基はhA3G、Vifそれぞれにおいて同定されてきた。hA3Gはドメインを2つもつが、N末端側ドメイン(NTD)にVif結合領域が含まれる。その一方で、hA3G NTD-Vif間相互作用のより深い理解に必要なhA3G NTD-Vif複合体の構造学的理解にはいまだ至っていない。本研究課題では、hA3G NTD-Vif複合体の構造学的理解をめざす。この複合体構造の決定により、VifあるいはhA3Gを標的とした、新たな作用機序をもつ抗HIV-1薬の開発に繋がるものと考える。
当該年度において、まずコンピュターシミュレーション(in silico)の手法を利用し、hA3G NTD-Vif複合体の構造予測を行った。hA3G NTDの立体構造をアカゲザルA3G NTD二量体のX線結晶構造情報(PDB 5K83)をもとにホモロジーモデリング法で予測した。このhA3G NTDの予測構造とVifのX線結晶構造(PDB 4N9F)を用い、ROSETTAプログラムあるいはCLUSPROプログラムにてhA3G NTD-Vif複合体の構造予測を行った。結果、もっとも両者の接触面積が大きいモデル構造として、VifがhA3G NTDの二量体インターフェイス付近に結合するモデル構造を得た。このモデル構造においてhA3G NTD-Vif間結合に重要な既知アミノ酸残基は、hA3G NTDとVifのインターフェイスに位置した。このことから合理的なモデルを予測できたと考える。また、このモデル構造からこれまでに未報告のアミノ酸残基の相互作用への関与が推定された。さらに、モデル構造の妥当性の検証ならびに精密化のため複合体構造の分子動力学シミュレーションを開始した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当該年度において、hA3G NTD-Vif複合体構造の予測ならびにhA3G NTD-Vif間相互作用に関わると推定される候補アミノ酸残基を新たに見出すことをめざした。予測したhA3G NTD-Vif複合体構造は、hA3G NTD-Vif間相互作用に重要との報告があるアミノ酸残基がhA3G NTDとVifとのインターフェイスに位置していたことから、合理的なモデル構造であると考えられる。さらに、モデル構造から、hA3G NTD-Vif間相互作用に関与すると推定される候補アミノ酸残基も見出した。モデル構造の妥当性を検証し、さらにモデル構造を精密化するため、分子運動を考慮した分子動力学シミュレーションも開始した。したがって、おおむね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
次年度以降において、hA3G NTD-Vif間相互作用に関与すると推定される候補アミノ酸残基について、コンピュターシミュレーション(in silico)および試験管内(in vitro)での実験により検証を行う。in silico実験では、分子動力学シミュレーションにより分子運動を考慮したシミュレーションを行い、相互作用の安定性の検証やモデル構造の精密化を行う。一方、in vitro実験ではhA3G NTD変異体、Vif変異体の発現ベクターを作製し、HEK293T細胞にco-transfectionすることで、VifによるhA3Gの分解を評価する。分解が阻害された場合、変異導入により相互作用が低下したことを意味する。つまり、変異した箇所のアミノ酸残基がhA3G NTD-Vif間相互作用に関わることを示唆する。
さらに、hA3G NTD-Vif間結合を安定化させると推定される変異体をモデル構造からデザインし、デザインした複合体を大腸菌発現系で大量培養する。hA3G NTDとVifの複合体としての安定性、回収効率を確認することで、高親和性のhA3G NTD-Vif複合体を取得し、X線結晶構造解析による実構造の決定に繋げる。hA3G NTDやVifは難溶性のタンパク質であるため、可溶化の条件検討が必要な可能性がある。これらタンパク質の可溶化については、アカゲザルA3G NTD、Vifの結晶構造解析の条件を参考に検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当該年度において8,045円の次年度使用額が生じた。当該年度においてはコンピュータシミュレーションに基づく実験を主に行ってきたものの、次年度以降は試験管内(in vitro)での実験を行っていくことを計画している。そのため、高価である抗体などの実験試薬を次年度以降に購入するため、当該年度分の一部を次年度に分配した。
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