| 研究課題/領域番号 |
17K08962
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
渡部 正彦 帝京大学, 医療共通教育研究センター, 准教授 (90301788)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | タンパク質相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
シナプス伝達障害が主な病因の一つと考えられるうつ病において、神経伝達物質貯蔵小胞の細胞内輸送に密接に関与しているRabタンパク質の制御機構の解明は、既存の抗うつ薬とは異なる新たな薬物標的となり得ると考えられるので大いに期待できる。これまでの自身の研究とこれまでの報告内容を整理して互いの関連性を調べると、特に五つのタンパク質CK2、Hsp90、HDAC6、Rab、GTRAP3-18とうつ病との関連性を明確にすることが重要であり、新規抗うつ薬の開発のための理論的基盤構築を可能にし得るものであると判断し、昨年度に引き続き五つのタンパク質の活性調節経路の重要性を明らかにすることを目的として本研究を行った。
昨年度、上記タンパク質のうちの一つGTRAP3-18を細胞内に強制発現させると細胞死を誘導し、上記タンパク質のうちのもう一つであるRabタンパク質をGTRAP3-18と共に細胞内に強制発現させると、GTRAP3-18による毒性が抑えられるという二つのタンパク質における関係性を明らかにすることができた。
そこで本年度はGTRAP3-18と他の残りのタンパク質との細胞内での関係性を明らかにしようと試みたが、GTRAP3-18を細胞内に強制発現させるとGTRAP3-18の毒性が強いため、細胞内でGTRAP3-18と他の残りのタンパク質との関連性を調べることができなかった。そこで、GTRAP3-18の毒性を軽減することはできないかと試行錯誤したところ、蛍光タンパク質GFPを結合させたキメラタンパク質GFP-GTRAP3-18としてなら、GTRAP3-18を細胞内に強制発現させても細胞死を誘導しないことを見出したので、論文としてまとめ報告した (Protein Expr Purif. 2018 Aug; 148:40-45)。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
昨年度、五つのタンパク質の一つGTRAP3-18の発現ベクターを作製し細胞内に導入してGTRAP3-18を強制発現させると細胞死を引き起こしたので、GTRAP3-18への結合報告があるRabタンパク質の一つRab1aをGTRAP3-18と共に細胞内で共発現させたところ、Rab1aとGTRAP3-18が共発現している生細胞の観察に成功したことから、Rab1aとGTRAP3-18との関係性を明らかにすることに成功した。
そこで、本年度はGTRAP3-18と他の残りのタンパク質との細胞内での関係性を明らかにしようと試みたが、GTRAP3-18を細胞内に強制発現させるとGTRAP3-18の毒性が強いため、細胞内におけるGTRAP3-18と他の残りのタンパク質との関連性を調べることができなかった。そこで、GTRAP3-18の毒性軽減を試行錯誤した結果、キメラタンパク質としてGTRAP3-18を細胞内に強制発現させることでこの問題を打破することに成功した。組み合わせるタンパク質としては汎用されている蛍光タンパク質GFPを選択し、また今後のタンパク質相互作用への影響を考慮して、GFPをGTRAP3-18のN末、C末および両末端に結合させた3種類のキメラタンパク質GFP-GTRAP3-18の発現ベクターの構築を行った。構築に成功したGTRAP3-18の発現ベクターを酵母に導入して細胞内にキメラタンパク質GFP-GTRAP3-18を強制発現させたところ、N末、C末および両末端に結合させた3種類の何れのキメラタンパク質においてもGTRAP3-18の毒性を回避することに成功し増殖を示した。この結果から、GTRAP3-18と他の残りのタンパク質との細胞内での関係性を明らかにすることが可能となったので、現在、残りの三つのタンパク質CK2、Hsp90、HDAC6の発現ベクターの作製に取り掛かっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
ここまで当初の研究計画通りとはいかなかったものの、新たな現象を見出し、研究を進め、毒性を有するタンパク質の細胞内発現で上手くいかず困っている多くの研究者へ一筋の光を提供できる意義ある研究内容を査読ある研究雑誌に報告できたので、最終年度である今年度は当初の計画に沿って、五つのタンパク質のうち、残りの三つのタンパク質CK2/Hsp90/HDAC6に着目し、ヒト由来培養細胞HEK293およびSH-SY5Yを用いて強制発現系を構築させ、それぞれのタンパク質の機能を調べる。まずはGTRAP3-18とRabの2種類のタンパク質の発現ベクターしか作製に成功していないので、残りのCK2/Hsp90/HDAC6三つのタンパク質の発現ベクターの構築を行っていく。作製でき次第、ヒト由来培養細胞HEK293およびSH-SY5Yに導入・強制発現させ、細胞に及ぼす影響を調べる。Rab1aとGTRAP3-18の関係のように残りのCK2/Hsp90/HDAC6三つのタンパク質に関して、その役割・機能を明確にしていく。
また、Rab1aとGTRAP3-18の関係性は明確にすることができたが、互いに直接結合しているか否かは未だわからないので、CK2/Hsp90/HDAC6三つのタンパク質に関する情報が得られた後に、五つのタンパク質各々の抗体を用いた免疫沈降等を行い、沈降物中に含まれるタンパク質を各抗体で検出していくことで、五因子がどのような組み合わせで複合体を形成しているのか、詳細を明らかにしていく。
以上のごとく、当初の研究計画通りに行えるよう、五つのタンパク質の関連・重要性を、培養細胞を用いて明確にしていく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の研究計画では五つのタンパク質CK2、Hsp90、HDAC6、Rab、GTRAP3-18すべての発現ベクターを作製して検討を行う予定であったが、GTRAP3-18の発現ベクター作製成功後すぐに強制発現実験をおこなったところ、非常に興味深い現象がみとめられたことから、その現象の解明に方向性を定め優先的に検討をおこなったので、Rabの発現ベクターまでは作製し終えたが、未だ残りの三つのタンパク質CK2、Hsp90、HDAC6の発現ベクターができていない。また、当初の研究計画では上記の五つのタンパク質の関係性を調べるために、五つのタンパク質すべての抗体を購入して免疫沈降等を行い、沈降物中に含まれるタンパク質を各抗体で検出することで、五因子がどのような組み合わせで複合体を形成しているのかを調べる予定であったが、初年度はGTRAP3-18とRabとの興味深い現象解明を、次年度はGTRAP3-18自身がもつ毒性の軽減方法の確立を優先的におこなったため、未だに五つのタンパク質すべての抗体を購入しておらず、こちらの研究も最終年度での予定となっている。
したがって、当該助成金は当初の計画ではおこなえなかった発現ベクター作製費や抗体購入費等に使用し、翌年分として請求した助成金は次年度に計画していた内容に使用していく予定である。
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