| 研究課題/領域番号 |
17K08962
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| 研究機関 | 帝京大学 |
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研究代表者 |
渡部 正彦 帝京大学, 公私立大学の部局等, 准教授 (90301788)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | タンパク質相互作用 |
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| 研究実績の概要 |
うつ病の主な病因の一つとしてシナプス伝達障害が考えられることから、神経伝達物質貯蔵小胞の細胞内輸送に密接に関与しているRabタンパク質の制御機構の解明は、既存の抗うつ薬とは異なる新たな薬物標的となり得ると考えられるので大いに期待できる。これまでの自身の研究結果から、特に五つのタンパク質とうつ病との関連性を明確にすることが重要であると判断し、昨年度に引き続き五つのタンパク質の活性調節経路の重要性を明らかにすることを目的として本研究を行った。
初年度はGTRAP3-18を細胞内に強制発現させると細胞死を誘導し、Rabタンパク質をGTRAP3-18と共に細胞内に強制発現させると、GTRAP3-18による毒性が抑えられるという二つのタンパク質における関係性を明らかにすることができた (Biochem Biophys Rep 2018 Mar;14:16-9)。また、昨年度はGTRAP3-18と他の残りのタンパク質との細胞内での関係性を明らかにしようと試みたが、GTRAP3-18を細胞内に強制発現させるとGTRAP3-18の毒性が強いことが新たに判明し、試行錯誤の結果、蛍光タンパク質GFPを結合させたキメラタンパク質GFP-GTRAP3-18としてなら、GTRAP3-18を細胞内に強制発現させても細胞死を誘導しないことを見出したので、論文としてまとめ報告した (Protein Expr Purif. 2018 Aug;148:40-45)。
そこで本年度はGTRAP3-18と他の残りのタンパク質との細胞内での関係性を明らかにしようと、他の残りのタンパク質の発現ベクターの構築に取り組んでいたが、当初の想定通りとはいかず試行錯誤している最中に現在まで影響しているコロナ問題に突入してしまった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
初年度、五つのタンパク質の一つGTRAP3-18の発現ベクターを作製し細胞内に導入してGTRAP3-18を強制発現させると細胞死を引き起こしたので、GTRAP3-18への結合報告があるRabタンパク質の一つRab1aをGTRAP3-18と共に細胞内で共発現させたところ、Rab1aとGTRAP3-18が共発現している生細胞の観察に成功したことから、Rab1aとGTRAP3-18との関係性を明らかにすることができた。また、昨年度はGTRAP3-18と他の残りのタンパク質との細胞内での関係性を明らかにしようと試みたが、GTRAP3-18の毒性が強いため、細胞内におけるGTRAP3-18と他の残りのタンパク質との関連性を調べることができなかったので、キメラタンパク質としてGTRAP3-18を細胞内に強制発現させることでこの問題を打破することに成功した。
そこで、本年度はGTRAP3-18と他の残りのタンパク質との細胞内での関係性を明らかにしようと残りの三つのタンパク質CK2、Hsp90、HDAC6の発現ベクターの作製を試みていたが、昨年にこれまでお世話になった教授が退官となり、それに伴い研究実施場所の移動を余儀なくされたことで、研究実施環境を新たに一から作り上げるため、これまで使用していた機器の新たな購入や設置など研究の再稼働に想定外の時間を要してしまい、当初の想定通りとはいかず、当初の計画が遅延したまま、コロナ問題に突入してしまった。
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| 今後の研究の推進方策 |
ここまで研究実施場所の移動や研究実施環境を新たに一から作り上げるなど想定範囲外の状況に直面することで当初の研究計画通りとはいかなかったものの、初年度より新たな現象を見出し、研究を進め、毒性を有するタンパク質の細胞内発現で上手くいかず困っている多くの研究者へ一筋の光を提供できる等、意義ある研究内容を査読ある研究雑誌に報告できてきていたので、期間延長申請が承認いただけた最終年度である今年度は当初の計画に沿って、五つのタンパク質のうち、残りの三つのタンパク質CK2/Hsp90/HDAC6に着目し、ヒト由来培養細胞HEK293およびSH-SY5Yを用いて強制発現系を構築させ、それぞれのタンパク質の機能を調べていく。まずはGTRAP3-18とRabの2種類のタンパク質の発現ベクターしか作製に成功していないので、残りのCK2/Hsp90/HDAC6三つのタンパク質の発現ベクターの構築を行っていく。作製でき次第、ヒト由来培養細胞HEK293およびSH-SY5Yに導入・強制発現させ、細胞に及ぼす影響を調べる。Rab1aとGTRAP3-18の関係のように残りのCK2/Hsp90/HDAC6三つのタンパク質に関して、その役割・機能を明確にしていく。
また、Rab1aとGTRAP3-18の関係性は明確にすることができたが、互いに直接結合しているか否かは未だわからないので、CK2/Hsp90/HDAC6三つのタンパク質に関する情報が得られた後に、五つのタンパク質各々の抗体を用いた免疫沈降等を行い、沈降物中に含まれるタンパク質を各抗体で検出していくことで、五因子がどのような組み合わせで複合体を形成しているのか、詳細を明らかにしていく。
以上のごとく、研究実施環境を整備し当初の研究計画通りに行えるよう、コロナ問題と向き合いながら一歩ずつ邁進していく。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
当初の研究計画では五つのタンパク質CK2、Hsp90、HDAC6、Rab、GTRAP3-18すべての発現ベクターを作製して検討を行う予定であった。しかしながら、昨年にこれまでお世話になった教授が退官となったのだが、当初はその後も同研究室での研究続行可能の予定だったが、新教授着任に伴い研究実施場所の移動を余儀なくされたことで、研究実施環境を新たに一から作り上げなければならなくなったため、これまで使用していた機器の新たな購入や設置など研究の再稼働のための研究費の使用という想定外の用途が発生してしまい、当初の想定通りとはいかず、当初の計画の遅延が起こり、更に現在まで影響しているコロナ問題に突入してしまったため、期間延長申請が承認いただけたことから、本年度での使用予定となっている。
したがって、当該助成金は当初の計画ではおこなえなかった発現ベクター作製費や抗体購入費および研究実施環境整備費等に使用していく予定である。
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