|
手術摘出されたヒト甲状腺組織とコントロールとしてラットより摘出した甲状腺組織を酵素で分解して単一細胞としたものを使用して解析を行った。その際、拐取された細胞数が少なく組織分散の過程に改良を要することがわかったため、組織分散のプロトコールの改良を試みた。従来はコラゲナーゼで処理した後、溶血操作を加え、その後コラゲナーゼ、ディスパーゼ混合液で分散を継続、最後にプロテネースで単一細胞にまで分散していたが、プロネースを使用することで細胞数の減少を認めることがあった。今回、途中でメッシュフィルターによるろ過の操作を加えることで、プロテネースを使用せず、コラゲナーゼとディスパーセのみで単一細胞にまで分散できることがわかった。今までの検討で使用したプロトコールに従い、組織から分散された単一細胞をメタノールとポリエチレングリコールを混合した固定液で固定した後、RNase阻害薬を加え-80Cで保存した。凍結されたこれらの検体を溶解して、従来法に従いRNAを極力分解させないプロトコールで蛍光標識した抗体で標識した。抗体については腫瘍組織は抗サイログロブリン抗体と抗TTF-1抗体の２重染色、ラット甲状腺とバセドウ病検体は抗サイログロブリン抗体と抗N-Cadherin抗体とで染色し、ぞれぞれ他の細胞群と明確な区別ができる細胞分画がないかどうか検討した。腫瘍組織から採取した細胞の一部ではTTF-1で陽性、サイログロブリンで陰性の分画があり、この分画をFACSにて分離、採取してRNAを抽出した。抗サイログロブリン抗体と抗N-Ｃadherin抗体で染色したラット甲状腺とバセドウ病組織から採取した細胞では明確な分画が確認できなかったため、染色条件等をもう一度見直すこととした。
|
