| 研究課題/領域番号 |
17K09018
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| 研究機関 | 奈良県立医科大学 |
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研究代表者 |
山本 惠三 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (90254490)
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| 研究分担者 |
矢野 寿一 奈良県立医科大学, 医学部, 教授 (20374944)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | カルバペネマーゼ / 基質特異性 / 構造解析 |
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| 研究実績の概要 |
平成３０年度は、①IMP-6、及び類似酵素の構造解析実験、②第２世代の進化酵素遺伝子のライブラリーの作製を行った。
まず、IMP-6の構造解析については、従来、3.0 Å程度の分解能の回折データしか得られなかったのに対し、結晶化条件、及び液体窒素で凍結させる際の条件を精密化し、2.2 Åを超える回折データを与える結晶を得ることに成功した。ただ、その成功率がまだ低いため、放射光施設を用いて回折データの取集を続けている。
また、昨年度に進化実験で得られたY123N変異型酵素のアミノ酸置換部位は、活性中心から離れた部位にある。同様に活性中心から離れた部位にある１アミノ酸置換が基質特異性に影響を及ぼす例として、CTX-M-1β－ラクタマーゼのAla219→Valの変異が報告されている。Ala219は、CTX-M型β－ラクタマーゼにおいて高度に保存されている。そこで、この両者に共通する構造変化があるかどうかを探るために、本邦で多く分離されるCTX-M-2、及びA219V変異型酵素の構造解析を行った。ところが、両者の構造にはほとんど差がなかったとともに、酵素学的パラメータも差が見られなかった。従って、このアミノ酸置換により基質特異性が変化する現象は、CTX-M-1に特異的であることが示唆された。
一方、第２世代の進化酵素遺伝子のライブラリーの作製については、Y123N変異型IMP-6遺伝子に対しランダムなアミノ酸置換を導入した。pHSG398-IMP-6-Y123Nを保有する大腸菌は0.004 mg/mLメロペネムまで生育するため、得られた864コロニーについて0.016 mg/mLのメロペネムを含むLB培地で培養したところ、68コロニーの大腸菌について生育が見られた。それらの遺伝子配列を決定したところ、のべ39か所の変異点が判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画では、平成３０年度において、IMP-6の立体構造解析が終了している予定であった。しかしながら、良好な回折データを与える結晶を得る結晶化、及び液体窒素保存条件の決定に時間がかかったために当該年度までの構造決定が行えなかった。このことについては、平成３０年度中に結晶化条件、及び液体窒素で凍結させる際の条件を精密化し、2.2 Åを超える回折データを与える結晶を得ることに成功したとともに、平成３１年４月にSPring-8でのデータ収集を行い、1.8 Å分解能の回折データを得た。既に3.0 Å分解能におけるIMP-6の構造を決定していることから、今回得られた回折データを用いて、原子レベルでの立体構造解析を行い、すでに立体構造が解明されているIMP-1との比較から、立体構造の違いと基質特異性の変化との相関関係の議論は可能であると考えている。
また、進化実験については、平成３０年度にpHSG398-IMP-6-Y123Nを保有する大腸菌に対し第２世代の変異型酵素遺伝子を作成し、十分な母集団数についてのスクリーニングを行った。既にこれらの変異型酵素のDNA配列は決定しており、アミノ酸置換が導入された位置は決定している。現在、これらのアミノ酸置換が立体構造上どのような位置にあるかの解析を行っている。また、これらの変異型酵素についての詳細なMIC測定、及び酵素学的性質の決定を遂行している状況であるので、令和元年度は当初の計画に沿った実験が可能であると考えている。
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| 今後の研究の推進方策 |
IMP-6の構造解析については、平成３０年度に結晶化条件、及び液体窒素で凍結させる際の条件を精密化し、2.2 Åを超える回折データを与える結晶を得ることに成功したことから、平成３１年４月にSPring-8でのデータ収集を行い、1.8 Å分解能の回折データを得た。すでに3.0 Å分解能におけるIMP-6の構造を決定していることから、今回得られた回折データを用いて、原子レベルでの立体構造解析を行い、すでに立体構造が解明されているIMP-1との比較を行うことで、両者の立体構造の違いを解明し、立体構造と基質特異性の変化との相関関係の議論を行う予定である。
第２世代の変異型酵素の解析については、既に十分な母集団数についてのスクリーニングを行ったうえ、個々の変異型酵素のDNA配列は決定しており、アミノ酸置換が導入された位置は決定している。そこで、これらのアミノ酸置換が立体構造上どのような位置にあるかの解析を行っている。また、これらの変異型酵素についての詳細なMIC測定、及び酵素学的性質の決定を遂行している状況にある。さらに、基質特異性の変化が見られた変異型酵素については、結晶化条件のスクリーニングを行い、構造解析実験を行う予定である。以上の実験を通して、IMP型β－ラクタマーゼにおいては、アミノ酸置換の導入によりどのように基質特異性が変化するか、アミノ酸置換の導入が立体構造に与える影響はどのようなものであるかという疑問に対する答えを得ていく予定にしている。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
今年度の予算執行において、次年度使用が生じた理由は、第２世代の変異型酵素の遺伝子ライブラリーは構築できたものの、それらを発現する大腸菌のMIC測定まで至らなかったことが原因である。現在、これらの変異型酵素についての詳細なMIC測定、及び酵素学的性質の決定を遂行している状況である。
また令和元年度は、基質特異性の変化が見られた変異型酵素については、結晶化条件のスクリーニングを行い、構造解析実験を行う予定である。これに必要な結晶化スクリーニングキットの購入を予定している。さらに、論文の投稿を予定している。以上を合わせると、令和元年度については、予定通りの予算執行が行えるものと考えている。
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