| 研究課題/領域番号 |
17K09102
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
高梨 さやか 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (20645709)
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| 研究分担者 |
春名 めぐみ 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 准教授 (00332601)
安戸 裕貴 山口大学, 大学院医学系研究科, 講師 (70422285)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ロタウイルス / 胃腸炎 / ワクチン / 免疫原性 / 母体由来因子 / 母乳 |
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| 研究実績の概要 |
ロタウイルスは小児急性胃腸炎の代表的な原因ウイルスであり、2 種類のロタウイルス経口弱毒生ワクチンが開発された。出生後半年以内に接種するため、母乳中の分泌型IgA や経胎盤IgG など母体由来の免疫学的要素がワクチンの効果を大きく左右するが、わが国においては母体要因に焦点を当てた研究は無い。本研究では、①日本人褥婦における母乳中抗ロタウイルス中和活性の測定②母乳・母体血清中抗ロタウイルスIgA、IgG 抗体の定量的測定③児のロタウイルスワクチンへの免疫応答と①②との相関の検討を目的とする。
平成30年度は、29年度に引き続き東京大学医学部附属病院産婦人科外来の後期妊婦健診（妊娠32週以降）受診者を対象に研究参加のリクルート活動を行った。同意が得られた方からの検体（健診時の残血清、初乳、成乳）、その児の検体［東都文京病院小児科における単価ロタウイルスワクチン（ロタリックス）接種前後の血清と便］の回収を行った。また、発達医科学教室にて、母体血清中抗ロタウイルス抗体（IgA,IgG）測定(ELISA)実験に着手した。ロタリックスワクチン原液をMA104 細胞（サル胎児腎細胞）に播種し、大量培養後、sucrose cushion を敷いて超遠心にて精製し、ELISA プレートをコートする抗原として用いた。標準血清の段階希釈によるstandard curve を作成し、標準血清の100 倍希釈時のOptical density 値を100 としたarbitrary unit として抗体価を定量化した。抗ロタウイルスIgG抗体では、36歳以上群の方が有意に抗体価が低かった。抗ロタウイルスIgA抗体は同様に年齢が高い群の方が平均値は低かったが、有意差は認められなかった。経産婦群の方が、初産婦群より抗ロタウイルスIgA抗体価の平均値は高かったが、有意差は認められなかった。今回の結果は、高年齢妊婦はロタウイルス好発年齢の児との接触機会が少ないために抗ロタウイルス抗体価が低くなる可能性を示唆すると考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
医学博士課程の学生をResearch assistantとして短期雇用してサンプリング活動の充実化を行い、研究参加者リクルートおよびサンプルの回収活動を当初の予定どおり、平成30年度内にすべて終了することができた。実験室的解析として、母体血清中抗ロタウイルス抗体測定実験に着手し、母体の年齢、および養育する児の数が血清中ロタウイルス抗体価(IgG)に影響を与える可能性を明らかにした。
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| 今後の研究の推進方策 |
引き続き下記の実験室的解析を行う。
①母乳中のロタウイルス中和活性の測定：ロタリックスと同じ遺伝子型G1P[8]のヒトロタウイルス標準株であるWa 株と、段階希釈した母乳（初乳、成乳）を混和してMA104 細胞上で培養し、細胞障害作用が見られなくなった希釈倍率をもって中和活性を評価する。母乳（初乳、成乳）中のロタウイルス結合蛋白の視覚化・半定量を目的に、抗Wa 株ポリクロ―ナル抗体を用いてWestern blotting を行う。
②ロタリックス排泄期間中のウイルス定量：ロタリックス接種後、継時的に採取した便を対象として、ロタウイルスのNSP2 とVP4 遺伝子上に存在するロタリックス特異的遺伝子配列をターゲットとしたRealtime RT-PCR法（Gautam et al., 2014）を用いることにより、市中流行のwild type のコンタミネーションを排除してロタリックス株のみの定量を行う。
以下の3点に着目して全てのデータをまとめ、学会発表、論文作成を行う。１）母体由来免疫物質と児のロタウイルスワクチン免疫反応の相関、２）母体由来免疫物質と児のロタウイルスワクチン株クリアランスの相関、３）初乳、成乳中における抗ロタウイルス中和活性、抗ロタウイルスIgA、IgG 抗体量の差異の比較。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
以前同様のELISA実験を行っていた際の抗原固相化用プレートなどを使用することができ、予定より安価に血清ロタウイルス抗体価測定を行うことができた。
次年度に引き継いだ差引額は、ロタリックス排泄期間中のウイルス定量に用いるやや高額なRealtime RT-PCR試薬に使用予定である。
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