自然免疫因子を新規バイオマーカーとした非ウイルス性肝がんの早期診断法開発

2017 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 17K09159
• 研究機関: 山口大学
• 研究代表者: 田邉 剛 山口大学, 大学院医学系研究科, 教授 (80260678)
• 研究分担者: 山口 奈津 山口大学, 大学院医学系研究科, 助教 (40450671) ; 高橋 秀和 山口大学, 大学院医学系研究科, 講師 (90450402)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 非ウイルス性肝がん / バイオマーカー / 早期診断

研究実績の概要

非ウイルス性肝がんは生活習慣病が主なリスク要因になると考えられており、肝がん全体の約25％を占め、さらに増加傾向にある。早期診断法の開発が急務であるが、未だ診断システムは確立していない。本研究では、非ウイルス性肝がんの新たなハイリスク群同定と早期診断システムの確立を目的とした。初年度は検体収集をしつつ、以下の解析を行った。
(1) 血中microRNA解析：preliminaryな解析として、非ウイルス性肝がん、C型肝がん、糖尿病の各群のプール血清について、血中に多くみられるmicroRNA175種類をリアルタイムPCRにより解析した。その結果、非ウイルス性肝がんと糖尿病群の間で発現量が４倍以上変化する3種のmicroRNAを同定した。現在は、糖尿病と非ウイルス性肝がんステージIIのプール血清について752種のmicroRNAを解析するため、収集した検体の血清small RNA抽出を順次進めている。
(2)血中アミノ酸解析：これまでに収集した血清検体について20種類のアミノ酸濃度を解析した。非ウイルス性肝がん、C型肝がん、糖尿病の各群で比較した結果、非ウイルス性肝がん群ではオルニチンとシスチンが増加傾向、フェニルアラニンが低下傾向であるという結果を得ている。しかし、その差は比較的小さく、個々のアミノ酸単独ではスクリーニングに用いるバイオマーカーとして不十分であることが考えられた。今後はスコア等により、複数のアミノ酸のデータを統合して有用性を確認することを進めている。
(3) 自然免疫系因子等の遺伝子多型解析：血液試料より抽出したゲノムDNAについて解析を行っている。統計学的有意差は不十分であるものの、可能性のある遺伝子は複数個得られている。対照群である糖尿病の検体収集を今後進めていく。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

(1)血中microRNA解析：preliminaryな解析として、収集した血液検体のmicroRNA解析を実施し、非ウイルス性肝がんと糖尿病群の間で値が４倍以上変化する3種のmicroRNAを同定した。現在は、糖尿病と非ウイルス性肝がんステージIIのプール血清について752種のmicroRNAを解析するため、収集した検体について順次血清small RNA抽出を進めており、ほぼ予定通りである。
(2)血中アミノ酸解析：これまでに収集した血清検体について20種類のアミノ酸濃度を解析し、非ウイルス性肝がん群ではオルニチンとシスチンが増加傾向、フェニルアラニンが低下傾向であるという結果を得ている。しかし疾患群と対照群の差は比較的小さく、個々のアミノ酸単独ではスクリーニングに用いるバイオマーカーとしては不十分である可能性が考えられた。今後スコア等により、複数のアミノ酸のデータを統合して有用性を確認すること進めている。
(3)自然免疫因子等の遺伝子多型解析：血液試料より抽出したゲノムDNAについて解析を行い、統計学的有意差は不十分であるものの、可能性のある遺伝子は複数個得られている。対照群である糖尿病の検体収集を進めることにより、統計学的有意差が十分に得られることが考えられるので、今後は糖尿病患者の選択基準を変更する（現在は腹部CT/MRIにより肝がんを認めない被験者としているが、この条件を外す）か、バイオバンクから糖尿病患者のDNA検体の購入を検討している。

今後の研究の推進方策

当初の計画を一部変更し、引き続き検体を収集しながら以下の解析を進める。
(1)血中microRNA解析：糖尿病と非ウイルス性肝がんステージIIのプール血清を用いて752種のmicroRNAを解析し、群間で発現量が変化するものを候補microRNAとして同定する。これら候補microRNAについて、個々の血清を用いて発現量を解析し、群間で有意に変化するmicroRNAを同定する。
(2)自然免疫因子等の遺伝子多型解析：対照群である糖尿病群について、多型解析に必要な検体数を集めるため、糖尿病患者の選択基準を変更する（現在は腹部CT/MRIにより肝がんを認めない被験者としているが、この条件を外す）か、バイオバンクから糖尿病患者のDNA検体の購入を検討している。必要な検体数が集まり次第、解析を再開する。
(3)ctDNA解析：血清中のctDNAを次世代シークエンサー等により解析し、非ウイルス性肝がんで特異的に変化するctDNAを同定する。さらに血清から精製したエクソソーム中のctDNAを解析することも検討する。このような追加の解析を行う同意は被験者からすでに得られている。

次年度使用額が生じた理由

対照群である糖尿病患者の検体収集が遅れており、解析数が予定よりも少なかったため、次年度使用額が生じた。次年度は、計画を一部変更して、次世代シークエンサー等を用いたctDNA解析を行うことを計画している。また、バイオバンクからDNA検体を購入することも検討しており、これらに多く費用がかかることが見込まれるため、次年度に持ち越した研究費を充てる予定である。

研究成果

• [雑誌論文] The different roles of innate immune receptors in inflammation and carcinogenesis between races (2017)
  • 著者名/発表者名: Natsu Yamaguchi, Yoshimi Suzuki, M. H. Mahbub, Hidekazu Takahashi, Ryosuke Hase, Yasutaka Ishimaru, Hiroshi Sunagawa, Rie Watanabe, Yoshinobu Eishi, Tsuyoshi Tanabe
  • 雑誌名: Environ Health Prev Med 巻: 22 ページ: 70
  • DOI: 10.1186/s12199-017-0678-8
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Association of plasma free amino acids with hyperuricemia in relation to diabetes mellitus, dyslipidemia, hypertension and metabolic syndrome (2017)
  • 著者名/発表者名: MH Mahbub, Natsu Yamaguchi, Hidekazu Takahashi, Ryosuke Hase, Yasutaka Ishimaru, Hiroshi Sunagawa, Hiroki Amano, Mikiko Kobayashi-Miura, Hideyuki Kanda, Yasuyuki Fujita, Hiroshi Yamamoto, Mai Yamamoto, Shinya Kikuchi, Atsuko Ikeda, Naoko Kageyama, Mina Nakamura & Tsuyoshi Tanabe
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 7 ページ: 17616
  • DOI: 10.1038/s41598-017-17710-6
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Plasma free amino acid profiles evaluate risk of metabolic syndrome, diabetes, dyslipidemia, and hypertension in a large Asian population. (2017)
  • 著者名/発表者名: Natsu Yamaguchi, MH Mahbub, Hidekazu Takahashi, Ryosuke Hase, Yasutaka Ishimaru, Hiroshi Sunagawa, Hiroki Amano, Mikiko Kobayashi- Miura, Hideyuki Kanda, Yasuyuki Fujita, Hiroshi Yamamoto, Mai Yamamoto, Shinya Kikuchi, Atsuko Ikeda, Mariko Takasu, Naoko Kageyama, Mina Nakamura, Tsuyoshi Tanabe
  • 雑誌名: Environ Health Prev Med 巻: 22 ページ: 35
  • DOI: 10.1186/s12199-017-0642-7
  • 査読あり
• [雑誌論文] Associations of interactions between NLRP3 SNPs and HLA mismatch with acute and extensive chronic graft-versus-host diseases (2017)
  • 著者名/発表者名: Hidekazu Takahashi, Naoko Okayama, Natsu Yamaguchi, Yuta Miyahara, Yasuo Morishima, Yutaka Suehiro, Takahiro Yamasaki, Koji Tamada, Satoshi Takahashi, Arinobu Tojo, Shigetaka Asano & Tsuyoshi Tanabe
  • 雑誌名: Scientific Reports 巻: 7 ページ: 13097
  • DOI: 10.1038/s41598-017-13506-w
  • 査読あり / オープンアクセス