| 研究課題/領域番号 |
17K09165
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| 研究機関 | 東京慈恵会医科大学 |
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研究代表者 |
与五沢 真吾 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (70381936)
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| 研究分担者 |
柳澤 裕之 東京慈恵会医科大学, 医学部, 教授 (10200536)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ナノ粒子 |
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| 研究実績の概要 |
金属酸化物ナノ粒子は化粧品などに広く利用されているが、炎症などの曝露影響が懸念されている。一方で炎症は発がんなどと深く関係し、炎症に伴いマイクロRNAを内包するエクソソームを含む細胞外分泌膜小胞（EV）が放出され、がんの進展や転移に重要な役割を果たすと考えられている。当該年度はヒト大腸がん由来HT29細胞に、酸化亜鉛ナノ粒子（ZnO-650 (住友大阪セメント)、一時粒子径20-30nm）を曝露し、培地からEVを超遠心法により回収してSDS-PAGEによりタンパク質成分を解析したところ、標品中にエクソソームマーカー分子（CD9など）が含まれていることをウェスタンブロッティング法により確認した。ZnO-650曝露細胞由来EVと曝露しない細胞由来EVに含まれるタンパク質をSDS-PAGEして比較すると、数本のZnO-650曝露細胞由来エクソソーム標品でのみ観察されるバンドが観察された。このバンドがエクソソームに由来するものかどうか、界面活性剤Tx-100を用いて細胞膜を破壊した場合としなかった場合でトリプシンによるプロテアーゼ耐性を比較する試験を行ったところ、エクソソームの成分である可能性が示唆された。抗がん剤エトポシドを曝露させた場合についても曝露時に特異的なバンドを観察できた。今後は再現性を確認するとともに、ZnO-650曝露により発現量が変動するタンパク質を質量分析法によって同定しようと考えている。またタンパク質成分の解析と並行し、核酸成分（メッセンジャーRNAやマイクロRNA）についても解析を進めていきたいと考えている。また、化粧品に用いられていることなどを考慮し、ZnO-650をヒトケラチノサイトに曝露させてEVを回収し解析した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
計画では1年目に細胞が放出するエクソソームの分子解析を行い、金属酸化物ナノ粒子に曝露された際に特異的に含まれる成分を同定したいと考えていたが、収量の関係があり同定まで至らなかった。エクソソーム精製の条件検討に時間を要し、培養のさらなるスケールアップなどが必要になった。
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| 今後の研究の推進方策 |
ヒトケラチノサイト由来エクソソームの性状を分析し、精製条件を検討し、エクソソーム精製のために細胞培養スケールをアップさせて金属酸化物ナノ粒子曝露時のエクソソームの解析を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度に遂行予定だったマイクロアレイ解析やプロテオーム解析の委託を次年度に行うことになったため
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