| 研究課題/領域番号 |
17K09381
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
宮本 心一 京都大学, 医学研究科, 助教 (90378761)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 癌幹細胞 / インスリン様増殖因子 / 大腸癌 / MMP-7 / 癌微小環境 |
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| 研究実績の概要 |
インスリン様増殖因子(Insulin-like Growth Factor,IGF)は血清中では生理的な阻害分子であるIGF結合蛋白質(IGF binding protein, IGFBP)と結合して大部分が非活性型(IGF-IGFBP複合体）として存在する。IGFが生物学的作用を発揮するためにはプロテアーゼによるIGFBPの分解が必須である。われわれはMMP-7が6種類のIGFBPすべてを分解する酵素活性を持つことを見出した。さらに家族性大腸腺腫症のモデルマウス（ApcMinマウス）とMMP-7のノックアウトマウスをかけ合わせると大腸ポリープの発生が抑制されることから、MMP-7がIGFーIGFBP複合体を分解する結果、腫瘍微小環境内でIGFが活性化され、その抗アポトーシス作用が腫瘍の発生に重要であると考えられた。さらにわれわれはApcMinマウスにIGF中和抗体を投与するとポリープの発生が抑制されることも報告している（Mol Cancer Ther 2010;9(2):419-28）。一方、癌の根治を目指すには癌幹細胞を排除することが重要であり、癌幹細胞性を維持するために必要な生存シグナルの同定は癌幹細胞を標的とする治療開発に必須である。血清中のIGFが高いことが大腸癌のリスクになることや脳下垂体から成長ホルモンが過剰分泌され末梢組織でのIGF-1が増加する末端肥大症患者で大腸癌が多いことは、ヒトの大腸発癌においてもIGFが関わっていることを強く示唆する。1つの可能性としてわれわれはIGFシグナルが癌幹細胞性の維持に重要なシグナルであると想定した。そこでApcMinマウスで同定されたDclk-1陽性大腸腫瘍幹細胞に着目し、腫瘍幹細胞周囲の微小環境におけるIGFシグナルの重要性を証明し、大腸腫瘍幹細胞を標的とした新たな治療法の開発を目指している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
まずわれわれはApcMinマウスの腺腫から腫瘍オルガノイドを樹立した。それをホルマリン固定パラフィン包埋を行い、セルブロックを作成した。セルブロックを薄切し、オルガノイド中の腫瘍幹細胞におけるIGFシグナルの活性化を見るために、Dclk-1、MMP-7、IGF type1 受容体（IGF-1R）、リン酸化IGF-1Rの免疫染色を行った。しかしながら腫瘍オルガノイドにおいてDclk-1陽性細胞は視認されるものの、他の抗体は染色性が悪く、MMP-7陽性細胞の局在、Dclk-1陽性細胞におけるIGF-1Rの発現やリン酸化の評価が困難であった。正常腸管上皮において、パネート細胞はMMP-7陽性となりLgr5陽性幹細胞に接して存在し、wnt3を分泌することにより幹細胞ニッシェを構成していることが知られている。パネート細胞由来のMMP-7がIGFBPプロテアーゼ活性を持つことを考えれば、幹細胞ニッシェにおいて活性化されたIGFが幹細胞性維持に何らかの役割を持つことは十分想定される。特にIGFは足場非依存性増殖におけるアポトーシス耐性に寄与することから、少なくとも3次元培養であるオルガノイドの維持においては生存に有利な増殖因子である。さらにApcMin由来の腫瘍幹細胞はApc変異によりWntシグナルが恒常的に活性化されており、Wntシグナルの下流にあるMMP-7はDclk-1陽性腫瘍幹細胞自身からも分泌されることが想定される。理論的には生体内の腫瘍幹細胞ニッシェにおいてはMMP-7はオートクライン、パラクラインの両方から作用し、より効率的にIGFが活性化されていることが正常腸管上皮幹細胞ニッシェとの違いかもしれない。
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| 今後の研究の推進方策 |
上述したように、オルガノイドを用いた免疫染色での評価は難しいと考えられるが今後も、抗体を変えて実験を継続予定である（マウスMMP-7の抗体はすでに免役染色に使用可能なものが手元にある）。同時にApcMinマウスのポリープにおいても同様の検討を試みる。一方、腫瘍オルガノイドは継代を重ねるにつれ、Dclk-1陽性細胞が減少していくことも問題であり、培養系にIGF（±IGF中和抗体）、MMP阻害剤などを添加し、Dclk-1陽性細胞の数やオルガノイドの形態にどのような変化が起こるかを検討する予定である。しかしながらオルガノイドの培養には必ずしも血清（IGF-IGFBP複合体が含まれる）を必要とせず、またMMP-7は不活性型の前駆体で分泌され、その活性化には間質細胞から分泌される他のプロテアーゼによる限定分解が必要である。オルガノイドの系も含めin vitroの系では間質の細胞を含まず、分泌されたMMP-7の活性化を評価できない。そのため、生体内での腫瘍幹細胞ニッシェにおけるMMP-7の活性化ひいてはIGFシグナルの活性化をin vitroの系で評価するには限界がある。以上より当初の研究計画の遂行はかなり難しい状況にあるが、まずは腫瘍オルガノイドの培養系にIGFを添加した時にオルガノイドの寿命や形状に与える影響を確認したい。またDclk-1陽性細胞はかなり少ない細胞集団であるため技術的には困難と考えるが、腫瘍オルガノイドやApcMinマウスのポリープからDclk-1陽性細胞だけをソーティングできればIGF-1Rの発現およびそのリン酸化状態を直接確認することが可能と考える。
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