研究課題
研究代表者らは、独自に確立した手法で純化したヒトiPS細胞由来肝幹・前駆細胞を用いて、HBV持続感染に関わる自然免疫応答回避機構および発癌に関わる分子機構と、異なるgenotype間における病態の差異を明らかにすることを目的として研究を遂行し以下の実績を得た。1. HBV持続感染に関わるHBVの自然免疫応答回避機構の解明：肝癌細胞株を用いて、HBVの発現時における、ISRE promoter活性、ISG15, PKRなどの各種ISGや自然免疫関連分子のmRNAや蛋白の発現量、蛋白リン酸化の変化を評価した。その結果、ISRE promoter活性はHBV発現により抑制された一方、複数のISGや自然免疫関連分子の発現上昇を認めた。以上より、HBV発現は自然免疫応答の活性化に関わるが、一部はHBVにより抑制され活性化の程度が不十分である事が示唆された。2. HBV起因肝癌における分子機構の解析：STINGと肝癌との関係を検討するにあたり肝癌細胞株におけるSTINGの発現をwestern blottingで確認したところ、HuH7細胞ではその発現を認めたが、HepG2細胞での発現は明らかでなかった。また、HBVおよびHBx蛋白発現プラスミドをHepG2細胞に導入しSTINGのmRNA発現を解析したところ、発現量の変化は明らかでなかった。3. HBVのgenotype間による慢性化率や発癌率の差を規定する機構の解明：1の検討でHBV発現により発現に変化を認めた分子に関して、異なるgenotypeのHBVプラスミドを用いて同様の検討を行った。その結果、HBV発現によるISRE promoter活性の抑制や複数のISG発現はgenotype Cではgenotype A, Bに比しやや弱いという結果であり、特に後者の結果はgenotype Cで慢性化しやすいことと関連がある事が示唆された。
2: おおむね順調に進展している
1. HBV持続感染に関わるHBVの自然免疫応答回避機構の解明、に関しては当初の計画通り研究を進めることができ、一定の成果を得ることができた。すなわち、HBV発現により複数の自然免疫応答分子の発現変化が認められ、HBV感染が自然免疫応答を惹起すること、およびHBVによる自然免疫応答抑制機構の存在が示唆された。そこで、当初平成30年度に計画していたHBVのgenotype間による慢性化率の差を規定する機構の解析、を一部平成29年度に計画を早めて行った。異なるgenotypeのHBVプラスミドを用いた検討から、genotypeにより自然免疫応答への影響の度合いが異なることが示唆され、解析を進めることによりHBVの持続感染メカニズムの一端を明らかにしうる重要な知見と考えられた。2. HBV起因肝癌に関わる分子機構の解析に関しては、肝癌細胞株でも株種によってSTINGの発現量が異なるがことが明らかとなった。HBV起因肝癌におけるSTINGの発現を解析するにあたり、患者から得られた肝癌検体の採取は既に進行中であり、準備が整い次第肝組織検体を用いた解析を進めることができる状態である。また、短期的な検討では、HBV発現によるSTINGの発現の変化は明らかでなかったが、今後長期的なHBV発現下での解析を行うことにより、持続感染下におけるSTINGの発癌への寄与を明らかにしうると考えられる。以上のように、研究計画はおおむね順調に進展しているものと思われる。
1. HBV持続感染に関わるHBVの自然免疫応答回避機構の解明：これまでの検討から、HBV感染が自然免疫応答を惹起すること、およびHBVによる自然免疫応答抑制機構の存在が示唆された。しかし、肝癌細胞株では自然免疫経路が正常とは異なる可能性がある事から、今後ヒトiPS細胞由来肝幹・前駆細胞を用いてこの結果を検証していく。また、HBVのRIG-Iに対するpathogen-associated molecular pattern (PAMP)として報告されている5’-εを発現させ、個々のウイルス蛋白を強制発現した時の自然免疫関連分子の発現変化や自然免疫応答の活性化を見ることにより、HBVの自然免疫応答抑制作用に重要なウイルス蛋白の同定、またその標的となり得る分子の同定を試みる。更に、genotype間の比較ではHBV plasmidの導入効率やHBV蛋白発現量等が用いたplasmidによって異なっており、これらをnormalizationさせて比較することによってより明確な結果が得られるものと考えられる。以上の解析より、できた場合には、その分子の肝生検組織における局在や血清中の動態に関する解析も併せて検討する。2. HBV起因肝癌に関わる分子機構の解析に関しては、まずSTINGのHBV発癌への関与についてHBVをstableに発現あるいは感染させた細胞におけるSTINGの発現量の変化を解析することにより、長期的な解析を行う。特にヒトiPS細胞由来肝幹・前駆細胞を用いることにより、非肝癌細胞におけるHBV発現の影響を見ることができると考えられる。また、患者から得られた肝癌検体を用いてHBV起因肝癌と他疾患由来の肝癌でのSTINGの発現について比較検討を行う。更に、STING以外のHBV発癌に関与する分子の同定を行うため、iPS細胞由来肝幹・前駆細胞を用いたHBV発現系あるいは感染系により、発現に変化をきたす分子をmicroarray等で網羅的に解析を行うことも検討する。
理由： 試薬等が計画当初より廉価で購入可能であったため。使用計画：検討する数・種類を拡大して解析を行うため、試薬を増量して購入する予定である。
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