研究課題
ヒト肝細胞移植TK-NOGマウスに、B 型肝炎ウイルス（hepatitis B virus：HBV）を感染後、ヒト末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell；PBMC）を投与することにより、重症肝炎モデルが作製された。本モデルでは肝臓内に特異的細胞障害性T細胞（cytotoxic T cell；CTL）が検出され、著明なHBV感染肝細胞の障害が生じ、HBVも次第に排除されていった。HBVの持続感染および特異的CTLによる慢性肝炎を生じるモデルの作製には、より強い免疫不全状態が必要と考え、JAK3(-)(-)/cDNA-uPAマウスにヒト肝細胞を移植し、HBVが感染し得ることを確認した。さらに本マウスに核酸アナログあるいはPEG-IFNを投与することにより、血中HBV DNA量の低下が認められた。持続肝炎モデルを作製するため、本マウスにヒトPBMCを投与したが、移植片対宿主反応（graft versus host disease；GVHD）のため、PBMCの生着には至っていない。HBV感染uPA/SCIDマウスに対し、entecavir とPEG-IFNα2aを併用投与することにより、血中HBV DNA量は検出感度以下に低下する。血中HBV DNAの陰性化後、抗HBs人免疫グロブリン（human anti-HBs immunoglobulin；HBIG）を投与し、肝細胞内への再感染を抑制することにより、一部のマウスでは抗HBV薬を中止した後も血中HBV DNAが持続陰性化した。またこれらのマウスに対し、バイポーラを用いて肝切除することより、経時的に肝細胞を採取する手技を獲得した。今後、経時的な肝内HBV DNAあるいはcccDNAの測定を行っていく。
3: やや遅れている
HBV感染マウスに対し、ヒトPBMCを投与することにより、重症肝炎モデルを作製した。しかしHBV持続感染および慢性肝炎モデルの作製には至っていない。GVHDあるいは移植肝細胞と投与したヒトPBMCのアロ応答が原因と思われ、これらの反応を抑制する工夫が必要と考えている。高用量の抗HBV薬（entecavirおよびPEG-IFN）を組み合わせて投与することにより、血中HBV DBAあるいは肝臓内cccDNAは低下することが確認された。この結果は、免疫システムがなくとも、薬剤により肝臓内cccDNAを十分に低下させることにより、薬剤中止後も肝臓内HBVの制御が可能となることを示すものであったが、本研究の目的として、アデノウイルスベクターを用いたCRISPR-Cas9システムの作製およびHBV培養細胞を用いたターゲット遺伝子の探索を挙げていた。CRISPR-Cas9システムはすでに作製済みであるが、アデノウイルスベクターへの挿入するAdeno-CRIPR-Cas9の作製が未実施である。来年度以降、手技的な検討を再考し、Adeno-CRIPR-Cas9の作製を行っていく。
より高度な免疫不全マウスに肝細胞移植を行い、HBV感染、ヒトPBMC投与を行い、HBV持続感染および特異的CTLによる肝炎モデルの作製を試みる。GVHDに対しては、マウスと反応を起こさないヒトPBMCを探索していく。肝細胞とのアロ応答の抑制には、あらかじめdish内にてPBMCと移植肝細胞を共培養し、応答を起こさなかったPBMCを選出し投与するなどの工夫を行っていく。抗HBV薬で肝臓内HBV cccDNAを十分低下させることに加え、さらにCRIPR-Cas9システムを用いることにより、HBV cccDNAが排除される可能性がある。引き続きHBV感染マウスを用いて肝臓内cccDNAを低下させる抗HBV薬の探索を行う。またCRISPR-Cas9をアデノウイルスベクターに挿入し、Adeno-CRIPR-Cas9を作製し、HBV発現細胞においてその有効性を検証する。昨年度と同様に本年度も研究代表者は、本研究に十分な時間を費やすことが困難であった。来年度は研究協力者と伴に研究への時間を十分に確保することとしている。最終的にはB型慢性肝炎モデルマウスを作製し、これを用いて抗HBV薬およびCRIPR-Cas9システムによるHBV完全排除を行うことを目的とする。
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すべて 国際共同研究 (1件) 雑誌論文 (1件) (うち国際共著 1件、 査読あり 1件)
Hepatology
巻: 68 ページ: 473-484
10.1002/hep.29891
