| 研究課題/領域番号 |
17K09443
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| 研究機関 | 大阪医科大学 |
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研究代表者 |
林 道廣 大阪医科大学, 医学部, 教授 (90314179)
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| 研究分担者 |
高井 真司 大阪医科大学, 医学研究科, 教授 (80288703)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | キマーゼ / 大豆サポニン / 非アルコール性脂肪性肝炎 / レニン |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、レニンとキマーゼの阻害作用を有する大豆サポニンの非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）に対する影響を解析することであり、今年度の計画は、ハムスターに高脂肪と高コレステロールを含有する餌（フナバシファームにて作製）で飼育することで臨床のNASH患者に類似したモデルを作製し、大豆サポニンのターゲットであるレニンとキマーゼの動態解析を行うことであった。
ハムスターに高脂肪と高コレステロールを含有する餌（HFC餌）を与え始めた後、４週の時点で正常餌に比べて体重が有意に増加し、その後、12週の時点まで有意な増加を認めた。12週の時点で血圧を測定したところ、正常餌群と有意差はなかったが135 mmHgと高値であった。また、血中の総コレステロールとトリグリセリドは共にHFC餌群で有意な高値を示し、空腹時血糖値も有意な高値を示した。肝臓の組織解析の結果、正常餌群では見られない著明な脂肪滴の増加と線維化面積の増大が確認され、炎症マーカーであるTumor necrosis factor(TNF)-αの発現量も有意に増加していた。これらの結果より、ハムスターにHFC餌を与えて飼育することで、臨床のNASH患者に類似したメタボリックシンドロームに起因するNASHモデルが形成されることが確認できた。HFC餌で飼育後12週の時点の血中レニン活性は、正常餌で飼育したハムスターと有意な差はなかった。一方、肝臓組織の解析において、キマーゼ発現細胞が有意に増加し、肝臓組織中のキマーゼ活性も有意に増加していた（論文発表）。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
今年度の研究計画の目的の一つは、メタボリックシンドロームに起因する非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）モデルを作製し、そのNASHの発症または進展機序におけるレニンおよびキマーゼの動態解析を行うことであった。
実績の概要にも記述したように、ハムスターに高脂肪と高コレステロールを含有する餌（HFC餌）を与えることで、有意な体重増加（肥満）に加え、血圧上昇、空腹時血糖値の有意な上昇、血中総コレステロール値およびトリグリセリド値の有意な上昇を認め、メタボリックシンドロームを発症していることが確認できた。また、肝臓の組織解析の結果、著明な脂肪滴の増加と線維化面積の増大が確認され、炎症マーカーであるTumor necrosis factor(TNF)-αの発現量も有意に増加していたことより、本モデルにおいてNASHの発症が確認できた。これらの結果より、ハムスターにHFC餌を与えることでメタボリックシンドロームに起因するNASHモデルが作製できることを確認できた。
もう一つの研究目的であったレニンおよびキマーゼの動態解析として、本NASHモデルにおいて血中のレニン活性が測定できることが確認できた。但し、血中レニン活性はNASHモデルでも低値で、正常ハムスターとの間に差はなかった。一方、肝臓のキマーゼ活性およびキマーゼ陽性細胞数は、NASHモデルで有意に増加していた。また、肝臓のアンジオテンシンⅡ産生活性も有意に増加していたことより、肝臓組織中のキマーゼ由来アンジオテンシンⅡが本病態機序に関与している可能性を確認できた。
以上より、当初の計画はおおむね順調に進展していると考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
今年度は、平成29年度に確立したハムスターに高脂肪と高コレステロールを含有する餌（HFC餌）で飼育して作製する非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）モデルを用いて大豆サポニンの経口投与の影響を解析する予定である。
大豆サポニンの投与方法は、自由飲水にて行う予定である。雄性ハムスターの6週齢よりHFC餌と水道水で飼育する群、HFC餌と大豆サポニンを飽和状態で溶解した水道水（4 mg/ml）で飼育する群、正常食群の3群を作製し、12週間飼育する予定である。
HFC餌負荷前および負荷後4週、8週、12週の体重および血圧を測定する。HFC餌負荷後12週の時点で、血中の総コレステロール値、トリグリセリド、AST、ALT、レニン活性、アンジオテンシンⅡ濃度を測定する。HFC餌負荷後12週の肝臓を摘出し、肝臓組織切片を用いてヘマトキシリン・エオジン染色にて脂肪滴の定量、シリウスレッド染色にて線維化面積率の計測、トルイジンブルー染色にて肥満細胞数の定量、抗キマーゼ抗体を用いたキマーゼ免疫染色にてキマーゼ陽性細胞数の定量を行う。また、残りの肝臓組織を用いてキマーゼ、炎症マーカーのTumor necrosis factor(TNF)-α、線維化関連因子のTransforming growth factor(TGF)-βおよびコラーゲンの遺伝子発現量をリアルタイムPCRにて定量し、キマーゼ活性はアンジオテンシンIを基質として測定する。
研究計画を本学実験動物センターへ提出しており、現在、承認待ちである。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
成29年度にハムスターに高脂肪と高コレステロールを含有する餌（HFC餌）で飼育して作製する非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）モデルの継時的な解析も予定に入れていた。具体的には、HFC餌負荷前の8匹、HFC餌負荷後4週および8週の各時点で正常餌群8匹、HFC餌群8匹の計32匹を解析する予定にしていたが、申請予算の減額を考慮して、これらのハムスターの購入を控えたため、解析費を含めて13万7910円の残金が生じた。
平成29年度の実験よりHFC餌負荷後12週の時点でメタボリックシンドローム誘発のNASHモデルが確立できたため、申請した計画通りに平成30年度は大豆サポニンのNASH発症に対する影響を解析する予定である。平成30年度も申請予算の減額があったため、平成30年度の計画を遂行するため、平成29年度の費用残額を次年度使用額とする。
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