| 研究課題/領域番号 |
17K09578
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
塚本 蔵 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (80589151)
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| 研究分担者 |
西田 優也 大阪大学, 医学系研究科, 特任助教(常勤) (10793440)
新谷 泰範 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (20712243)
朝野 仁裕 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (60527670)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ｃMLCK / キナーゼ活性化機構 / サルコメア |
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| 研究実績の概要 |
ｃMLCKの分子内活性制御機構の検討については、CaM結合ドメインを平滑筋型または骨格筋型のCaM結合ドメインと入れ替えたキメラcMLCKを作成した。これらを用いてcMLCK活性への影響を検討した結果、骨格筋型CaM結合ドメインを有するcMLCKキメラでは活性に変化はなかったが、平滑筋型のCaM結合ドメインを有するcMLCKキメラで活性の変化を認めた。
培養心筋細胞に進展刺激を加えると、培養心筋細胞のサルコメアの再構築が促進されるが、cMLCKをsiRNAでノックダウンした心筋細胞細胞ではサルコメアの再構築が抑制された。さらに、ノックダウンした心筋細胞をcMLCKをアデノウイルスでrescueするとサルコメアの再構築がrescueされた。また、現在、培養心筋細胞に圧負荷をかける装置を完成させた。圧負荷におけるcMLCKの役割に関する実験も開始している。
cMLCKを阻害する義天然ペプチド8種類（L1～L6, D1, D2）の中で、L3は100 nMの濃度で約50％の阻害活性を有していた。また、L3は平滑筋型および骨格筋型cMLCKへの作用は認めなかったことから、cMLCK特異的な活性modulatorであった。
cMLCKの結晶構造解析に関しては、現在、活性を保持したままN末端を少しずつ削っていき、単分散を得られる条件を調べている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
cMLCKのregulatory domainのキメラ作成により活性制御機構の一端を解明できた。
力学的負荷によるcMLCKのサルコメア構成での役割を解明できた。
cMLCK活性をmodulateする擬天然ペプチドを同定できた。
以上より、計画通り順調に進展している。
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| 今後の研究の推進方策 |
圧負荷におけるcMLCKおよびcMLCKのN末端の役割について検討する。
cMLCK活性をmodulateする擬天然ペプチドの酵素学的検討を行う。
cMLCKの結晶構造解析に向けて、単分散および結晶化条件を検討する。
AAVによる遺伝子デリバリーシステムを構築すると同時に、遺伝型心筋症マウスモデルを導入する。また、心筋症患者におけるMLC2vのリン酸化状態を検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
施設利用料の支払い等の為。
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