心臓特異的ミオシン軽鎖キナーゼの活性制御機構の解明と治療への応用

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17K09578
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 塚本 蔵 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (80589151)
• 研究分担者: 西田 優也 大阪大学, 医学系研究科, 招へい教員 (10793440) ; 新谷 泰範 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (20712243) ; 朝野 仁裕 大阪大学, 医学系研究科, 講師 (60527670)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 心不全 / ミオシン調節軽鎖キナーゼ

研究実績の概要

本研究は、ミオシン調節軽鎖キナーゼ（cMLCK）の活性制御機構の解明とcMLCKを標的とした心不全治療の有効性を評価することを目的とする。まず、力学的負荷刺激（伸展刺激と圧負荷刺激）によりcMLCKが活性化されミオシン調節軽鎖のリン酸化が増加することが確認した（生理学的制御機構）。また、cMLCKの欠損変異体を用いた検討にて、catalytic domainよりもN末端側は活性に必須ではないこと、C末端のregulatory domainは基質の認識にも関与することを確認した（分子学的制御機構）。さらにcalmodulinとcMLCKの共結晶構造解析に成功し、calmodulinによる活性化の機序を解明した（構造学的制御機構）。
次にヒトの不全心におけるcMLCKとミオシン調節軽鎖脱リン酸化酵素（MLCP）の発現レベルを比較検討し、不全心においてはcMLCKと比較してMLCPの発現が例外なく増加していることが確認した。また、拡張型心筋症の患者においてcMLCKをコードするMYLK3遺伝子のexon 9のacceptor siteの1塩基変異によるframe-shift変異を同定した。この変異によりcatalytic domainが途中から欠損してキナーゼ活性が完全に消失した変異cMLCKとなることが確認できた。さらにCRISPR/Cas9システムを用いてこの変異を導入したノックインマウスを作製に着手した。また、cMLCK活性を制御する手段として、まずは活性を制御する擬天然ペプチドの開発を試みた。RaPIDシステムによりcMLCKに対して高いaffinityを持つ擬天然ペプチドを8種類同定し、そのうち2種類がcMLCK活性を阻害した。一方、cMLCKをコードするAAV9ベクターの作製に着手し、培養心筋細胞およびマウスの心臓にcMLCKを発現させることに成功した。

研究成果

• [雑誌論文] Higd1a improves respiratory function in the models of mitochondrial disorder. (2020)
  • 著者名/発表者名: Nagao T, Shintani Y, Hayashi T, Kioka H, Kato H, Nishida Y, Yamazaki S, Tsukamoto O, Yashirogi S, Yazawa I, Asano Y, Shinzawa-Itoh K, Imamura H, Suzuki T, Suzuki T, Goto YI, Takashima S.
  • 雑誌名: FASEB J 巻: 34 ページ: 1859-1871
  • DOI: 10.1096/fj.201800389R
  • 査読あり
• [雑誌論文] In vivo real-time ATP imaging in zebrafish hearts reveals G0s2 induces ischemic tolerance (2020)
  • 著者名/発表者名: Kioka H, Kato H, Fujita T, Asano Y, Shintani Y, Yamazaki S, Tsukamoto O, Imamura H, Kogo M, Kitakaze M, Sakata Y, Takashima S.
  • 雑誌名: FASEB J. 巻: 34 ページ: 2041-2054
  • DOI: 10.1096/fj.201901686R
  • 査読あり
• [雑誌論文] Impact of cardiac myosin light chain kinase gene mutation on development of dilated cardiomyopathy. (2019)
  • 著者名/発表者名: Hodatsu A, Fujino N, Uyama Y, Tsukamoto O, Imai-Okazaki A, Yamazaki S, Seguchi O, Konno T, Hayashi K, Kawashiri MA, Asano Y, Kitakaze M, Takashima S, Yamagishi M
  • 雑誌名: ESC Heart Fail 巻: 6 ページ: 406-415
  • DOI: 10.1002/ehf2.12410
  • 査読あり
• [雑誌論文] Mutant KCNJ3 and KCNJ5 Potassium Channels as Novel Molecular Targets in Bradyarrhythmias and Atrial Fibrillation. (2019)
  • 著者名/発表者名: Yamada N, Asano Y, Fujita M, Yamazaki S, Inanobe A, Matsuura N, Kobayashi H, Ohno S, Ebana Y, Tsukamoto O, Ishino S, Takuwa A, Kioka H, Yamashita T, Hashimoto N, Zankov DP, Shimizu A, Sakata Y, Minamino T, Kitakaze M, Takashima S
  • 雑誌名: Circulation. 巻: 139 ページ: 2157-2169
  • DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.118.036761
  • 査読あり
• [雑誌論文] Endogenously released adenosine causes pulmonary vasodilation during the acute phase of pulmonary embolization in dogs (2019)
  • 著者名/発表者名: Takahama H, Asanuma H, Tsukamoto O, Ito S, Kitakaze M.
  • 雑誌名: Int J Cardiol Heart Vasc. 巻: 24 ページ: 100396
  • DOI: 10.1016/j.ijcha.2019.100396.
  • 査読あり
• [雑誌論文] A molecular triage process mediated by RING finger protein 126 and BCL2-associated athanogene 6 regulates degradation of G0/G1 switch gene 2 (2019)
  • 著者名/発表者名: Kamikubo K, Kato H, Kioka H, Yamazaki S, Tsukamoto O, Nishida Y, Asano Y, Imamura H, Kawahara H, Shintani Y, Takashima S.
  • 雑誌名: J Biol Chem 巻: 294 ページ: 14562-14573
  • DOI: 10.1074/jbc.RA119.008544
  • 査読あり
• [雑誌論文] Direct Sarcomere Modulators Are Promising New Treatments for Cardiomyopathies. (2019)
  • 著者名/発表者名: Tsukamoto O
  • 雑誌名: Int J Mol Sci. 巻: 21 ページ: E226
  • DOI: 10.3390/ijms21010226.
  • 査読あり
• [学会発表] Direct sarcomere activators for the advanced stage systolic heart failure (2019)
  • 著者名/発表者名: 塚本蔵
  • 学会等名: 第83回日本循環器学会学術集会
• [学会発表] Myosin Regulatory Light Chain Phosphorylation as a Modulator of Sarcomere Contractility (2019)
  • 著者名/発表者名: 塚本蔵
  • 学会等名: 第83回日本循環器学会学術集会
• [図書] 直接的サルコメア制御剤による新しい心不全治療薬の開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 塚本蔵
  • 総ページ数: 7
  • 出版者: 羊土社
• [図書] 心臓病における創薬開発、新たな治療介入で疾患を克服する (2019)
  • 著者名/発表者名: 山田憲明, 塚本蔵
  • 総ページ数: 8
  • 出版者: 日本医学出版