| 研究課題/領域番号 |
17K09643
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
横山 知行 群馬大学, 大学院保健学研究科, 教授 (70312890)
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| 研究分担者 |
前野 敏孝 群馬大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00436297)
須永 浩章 群馬大学, 大学院医学系研究科, 研究員 (10760077)
松井 弘樹 群馬大学, 大学院保健学研究科, 講師 (20431710)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 遊離脂肪酸 / 肺気腫 / Elovl6 / Sestrin |
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| 研究実績の概要 |
ELovl6は脂肪酸鎖長を延長する酵素で、細胞内での脂肪酸の動態を制御する重要な因子である。このことは、Elovl6活性の亢進または低下によって、細胞内の脂肪酸組成のバランスが変化すると、飽和脂肪酸あるいは一価不飽和脂肪酸による過剰な反応さらには細胞障害を引き起こし、疾患の進展に深く関わっていると考えられる。したがって、肺胞上皮での飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸のバランスが肺線維症および肺気腫の発症、進展機序に重要であると考えられる。
申請者らは肺におけるElovl6の発現および病態意義について検討を行った。その結果、Elovl6はⅡ型肺胞上皮細胞に発現が認められ、Elovl6欠損マウスにブレオマイシンで肺線維症モデルを作成したところ、野生型マウスと比較して著明な肺線維症の増悪を認めた。さらに、大変興味深いことに、Elovl6欠損マウスでは間質の線維化だけでなく、肺胞の破壊による気腫性変化も伴っていた。
そこで、野生型マウスに対して、マウス用喫煙曝露装置により2ヶ月および6ヶ月間、喫煙曝露を行うことで、肺気腫モデルマウスを作成し、このマウスにおけるElovl6の発現と脂肪酸組成について検討を行った。免疫組織化学染色の結果から、喫煙曝露2ヶ月の標本では、Ⅱ型肺胞上皮細胞におけるElovl6の明らかな発現増加が認められたが、喫煙曝露6ヶ月の標本では、2ヶ月の標本と比較すると発現は減少し、喫煙無処置の標本とほぼ同等のElovl6の発現レベルであった。
また、培養血管平滑筋細胞でのElovl6発現を枯渇させると、p53, p21の発現誘導およびmTORの発現低下を介した増殖能の著明な抑制とともに、活性酸素種（ROS）の産生増加、ストレス誘導因子Sestrin1,2の発現増加およびAMPKの活性化が認められた。一方、Sestrin3の発現は低下していた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
1) 肺気腫および肺線維症の病態モデル動物を作製し、肺でのSestrinの発現局在/AMPK活性/mTOR活性と脂肪酸分画、酸化還元状態および病態との関係を比較検討する。
喫煙2ヶ月モデルでは肺から抽出した蛋白のSestrin1,2および3の発現がいずれも低下していた。また、喫煙6ヶ月モデルでもSestrin1,2および3の発現が低下し、Elovl6ノックアウトマウスでは喫煙モデルと同様にSestrin1,2および3の発現が低下、さらに、Elovl6ノックアウトマウスに6ヶ月の喫煙を行うと、Sestrin1,2および3の発現は著明に低下していた。一方、p-AMPKは喫煙マウスで上昇が認められた。
2) 呼吸器疾患患者のSestrin発現とElovl6活性、脂肪酸分画、酸化還元状態を測定する。
肺気腫患者の血清ではSCD1活性が低下し、肺線維症患者の血清では、逆にSCD1活性が上昇していた、Elovl6活性は両群間では差が認められなかった。現在、疾患の重症度とElovl6活性、SCD1活性および脂肪酸分画との関連を検討中である。
Elovl6の発現をII型肺胞上皮特異的に欠損したコンディショナルノックアウトマウスを作製するため、SP-C promotor-Cre rtTA トランスジェニックマウスと、Elovl6 flox マウスを交配して、ドキシサイクリン誘導型のⅡ型肺胞上皮細胞特異的Elovl6 欠損マウスElovl6を作製し、現在、繁殖中である。コンディショナルノックマウスの作製にあたって、自然受精が成功せず、人工授精による繁殖を開始した。従って、本研究の主要課題である遺伝子改変動物による実験が当初の計画より遅延しているため、研究費の使用も一部、平成30年度に繰り越しとなっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
1) II型肺胞上皮特異的にElovl6発現を欠損したコンディショナルノックアウトマウスを用いて、肺でのSestrinの発現局在/AMPK活性/mTOR活性と脂肪酸分画、酸化還元状態および病態との関係を比較検討する。
ドキシサイクリン誘導型のⅡ型肺胞上皮細胞特異的Elovl6 欠損マウスとマウスとコントロール動物に長期喫煙曝露により肺気腫モデルと肺線維症モデルを作製し、肺組織中の遊離脂肪酸分画とリン脂質量、Elovl6、SP-CおよびSestrin1,2,3の発現と、肺気腫や肺線維症のマーカーとなる遺伝子群を定量する。さらに、 Sestrinによって制御され、蛋白合成に需要なPI3K/Akt/mTOR経路と細胞周期、細胞老化に重要なAMPK/p53/p21経路を遺伝子発現を測定する。
2) Elovl6あるいはSestrin遺伝子発現を培養Ⅱ型肺胞上皮細胞で過剰発現あるいはノックダウンさせ、Elovl6とSestrinの相互作用を細胞レベルで解明する。
Elovl6のsmall interfering RNA (siRNA)を作製し、培養Ⅱ型肺胞上皮細胞でのElovl6の発現をノックダウン、あるいはアデノウィルスElovl6発現ベクターを作製し、Elovl6を過剰発現する。Elovl6の欠損または過剰発現により細胞内の脂肪酸バランスがSestrinやAMPK、mTORの発現や細胞の機能、Viabilityに与える影響を検討する。
次に、Sestrin1,2および3のsiRNAを作製し、Elovl6をノックダウンした培養Ⅱ型肺胞上皮細胞あるいはElovl6を過剰発現した細胞に同時にトランスフェクションして、Elovl6の欠損または過剰発現による作用にはSestrinの発現が重要であることを明らかにするとともにその作用機序を詳細に検討する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
Elovl6の発現をII型肺胞上皮特異的に欠損したコンディショナルノックアウトマウスを作製するため、Elovl6をloxP遺伝子で挟んだElovl6 floxマウスを作製し、現在、繁殖中である。
コンディショナルノックマウスの作製にあたって、自然受精が成功せず、人工授精による繁殖を開始した。従って、本研究の主要課題である遺伝子改変動物による実験が当初の計画より遅延しているため、研究費の使用も一部、平成30年度に繰り越しとなっている。
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