| 研究課題/領域番号 |
17K09664
|
|---|
| 研究機関 | 自治医科大学 |
|---|
研究代表者 |
太田 洋充 自治医科大学, 医学部, 講師 (40451562)
|
|---|
| 研究分担者 |
萩原 弘一 自治医科大学, 医学部, 教授 (00240705)
海老名 雅仁 東北医科薬科大学, 医学部, 教授 (10280885)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| キーワード | ムチン / MUC4 / 遺伝子解析 / 次世代シークエンス / 薬剤性肺障害 / 気道上皮細胞 |
|---|
| 研究実績の概要 |
日本人は他国民と比較して、致死的な薬剤性肺障害の頻度が高い。その病理像は、重篤な好中球性炎症によるびまん性肺胞障害（diffuse alveolar damage:
DAD）である。本研究グループは日本人に薬剤性肺障害に関係する遺伝的な要因があると予想した。DADと診断された患者の検体を収集しエキソーム解析を行い、
肺で発現するムチン、MUC4を原因遺伝子の候補として同定した。さらに、DADの原因となる遺伝子変異が、繰り返し配列（VNTR）領域に存在すると予想し解析を
進めた。患者検体とコントロールとして市販されているDNAサンプルの計47検体について制限酵素による切断パターンをsouthern blottingにより解析し、少な
くとも6パターンあることを示した。さらに、DAD患者群では特定のパターンが多い傾向にあることを示した。さらに、現在、次世代シークエンサーを利用し、患者群でのMUC4 シークエンスパターンを解析中である。また、VNTRの6パターンのうち、頻度の高いと考えられる4パターンの遺伝子をクローニングし、発現ベクターを作成した。ただし、発現ベクターを実際に培養細胞に導入したところ、導入効率は10％以下であった。そのため、MUC4の安定発現細胞株を作成する方針とし、MUC4 発現ベクターをepisomalベクターで作成した。当初導入効率が不良であったが、piggyBacトランスポゾンベクターを作成し気道上皮細胞株である、BEAS2B細胞でMUC4を安定して発現する細胞株を得た。今後はこれらの細胞を用いて機能解析を行う予定である。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
研究1年目にMUC4の発現ベクターを作成する方針であったが、発現ベクターが巨大であり、培養細胞への導入効率は10％以下と不良であった。そのため、当初はepisomal vectorを作成しMUC4を安定して発現する細胞を作成する予定であったが、episomal vectorでは長期間培養すると発現効率が低下することがわかり、トランスポゾンベクターを再度作成し、MUC4を安定し発現する細胞を作成した。細胞の作成に時間がかかり機能解析が進んでいない。また、ベクターの作成をやり直すなどを行ったため時間を要し、初代気道上皮細胞を作成する予定が遅れている。
|
| 今後の研究の推進方策 |
MUC4を安定して発現する細胞を作成可能となったため、これらの細胞を使用してMUC4の機能解析を進める予定である。また、次世代シークエンスを使用しMUC4のVNTR領域を解析することが可能となったため、患者検体を使用し、びまん性肺胞障害に関係する遺伝子多型を決定する予定である。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
研究の進捗状況が遅れたため、MUC4発現細胞を使用した細胞の機能解析、また、次世代シークエンスを使用したMUC4の遺伝子多型の解析が進んでいないため、次年度使用額が生じた。今後は、請求した助成金と合わせてMUC4発現細胞の機能解析と次世代シークエンスを使用したVNTR領域の遺伝子多型の解析に研究費を使用する。
|
