2018 年度実施状況報告書

腎臓内RASの日内変動における肝臓由来AGTの糸球体濾過圧の関与

研究課題

研究課題/領域番号	17K09693
研究機関	浜松医科大学
研究代表者	大橋温浜松医科大学, 医学部附属病院, 特任講師 (50397387)
研究分担者	加藤明彦浜松医科大学, 医学部附属病院, 准教授 (60324357)
研究期間 (年度)	2017-04-01 – 2020-03-31
キーワード	腎臓内レニン-アンジオテンシン系 / アンジオテンシノーゲン / 糸球体過剰濾過 / in vivo imaging
研究実績の概要	平成30年度は、大量タンパク尿を呈し、慢性進行性の腎臓障害をきたすアドリアマイシン腎症ラットモデルの作成に注力した。アドリアマイシンの投与量や投与回数、及び評価時期を検討し、コントロールラットに比較し、有意な尿タンパクの増加を認め、血圧の上昇を認める状況が出来たため、アドリアマイシン腎症ラットモデルが確立できたと判断した。次に、FITCラベルした500kDaデキストランを、コントロールラットと上記確立したアドリアマイシン腎症ラットに静注し、in vivo imagingで観察を行った。コントロールラットに比較しアドリアマイシン腎症ラットでは、糸球体赤道面の濾過面積が有意に拡大する事、輸出細動脈径に対する輸入細動脈径の割合(輸入細動脈径/輸出細動脈径)が有意に増加する事を明らかとし、コントロールラットに比較してアドリアマイシン腎症ラットで、糸球体過剰濾過が生じていることをin vivo imagingで明らかに証明することが出来た。更には、上記モデルを用い、FITCラベルした500kDaデキストランを使用したin vivo imagingで、昼間(ラットにおける休眠期)と夜間(ラットにおける活動期)の輸入細動脈径/輸出細動脈径を比較し、コントロールラットでは日内変動を認めないが、アドリアマイシン腎症ラットでは、昼間より夜間で輸入細動脈径/輸出細動脈径が拡大していることを明らかにし、日内変動をin vivo imagingで明らかにした。加えて、Atto565ラベルしたヒトアンジオテンシノーゲンを作成した。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 3: やや遅れている理由多光子顕微鏡を用いてのin vivo imagingの実験は、当教室では全く初めての試みであったため、当初は非常に苦労し時間を要した。しかし、学内外からの御助言や御指導を通じて、手技や注意点が分かってきたため、最近では順調に実験が進行できるようになってきた。モデル動物については、当初は、当教室でやりなれており、腎臓内RAS活性が亢進していることが明らかであることから、5/6腎摘モデルを使用していた。しかし、腎臓の周囲との癒着の問題などのために、糸球体をきれいに描出することが出来ないため、in vivo imagingの実験には不向きであることと判断した。そのため、新たな慢性進行性の腎臓障害をきたすモデルであるアドリアマイシン腎症ラットモデルの確立が必要となったため時間を要したが、最近、モデル動物が確立したため、順調に実験が進行できるようになってきた。 Atto565ヒトアンジオテンシノーゲンは、当初、共同研究者からの供与を考慮していたが、実験量としては不足することや、蛍光抗体の減弱などより、再作成を余儀なくされた。そのため、時間を要したが、最近、新規のAtto565ヒトアンジオテンシノーゲンを作成し終えたため、今後は順調に実験が進行出来ることが期待される。
今後の研究の推進方策	今後の方針としては、確立したアドリアマイシン腎症ラットモデルに、糸球体濾過を抑制するレニン-アンジオテンシン系(RAS)抑制薬であるオルメサルタンと、全身血圧のみに影響する降圧剤(ヒドララジン)を投与し、コントロール群(C群)、アドリアマイシン腎症群(AD群)、AD群にオルメサルタンを投与する群(AD+O群)、AD群にヒドララジンを投与する群(AD+H群)を作成する。そのうえで、FITCラベルしたデキストランを静注し、糸球体面積や輸入細動脈径/輸出細動脈径から、糸球体過剰濾過を評価する。更には、それらモデル動物にAtto565ラベルしたアンジオテンシノーゲンを静注し、糸球体からの濾過量を評価する。次に、これら糸球体過剰濾過やアンジオテンシノーゲンの糸球体からの濾過量が昼間と夜間で異なるかどうかの日内変動を検討する。また、肝臓特異的なノックアウトマウスをMatsusakaらのグループより供与頂き、Wild type群と肝臓特異的なノックアウトマウス群の各々に、アドリアマイシンを加える群と加えない群を作成し、合計4群で、糸球体過剰濾過やその日内変動を評価する予定でいる。