| 研究課題/領域番号 |
17K09696
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
齋藤 尚二 名古屋大学, 医学部附属病院, 病院助教 (00635609)
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| 研究分担者 |
丸山 彰一 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (10362253)
榎本 篤 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (20432255)
坪井 直毅 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (50566958)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 線維化 / 間葉系幹細胞 |
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| 研究実績の概要 |
臓器線維化は全身臓器において慢性的な組織障害に付随してくる共通した病態であり、その重症度が予後を規定することが報告されている。臓器線維化とは創傷治癒における一つの転帰であり、あらゆる臓器の慢性疾患や老化による機能不全状態において普遍的に認められる組織変化である。腎臓においてはステージの進行した慢性腎臓病における腎繊維化がそれに当たる。
我々は線維化に深く関与する筋線維芽細胞のソースの一つとして間葉系幹細胞（Mesenchymal stem/stromal cell; 以下MSC）の重要性を見出し、最近MSCに特異的なマーカーとしてMeflin（特願2015-153712）を同定した。MSCがfibroblastやmyofibroblastへ分化するとMeflinの発現が低下あるいは消失する。本研究ではMeflinと腎線維化の関係に着目し、腎線維化におけるMeflinとMSCの詳細な細胞系譜解析を行い、線維化疾患の病因・病態解明を行い、新規治療の開発を目指している。
正常腎あるいは線維化した腎臓におけるMeflinの発現量と局在を検討している。各種腎線維化モデルを惹起し、経時的に腎組織を採取しMeflinの発現量や局在を検討した。正常腎でもMeflinは発現するが、各種疾患モデルを惹起するとMeflin陽性細胞の局在が変化し、発現量が上昇することを見出した。
各種腎臓由来の細胞株や初代培養細胞を用いてもMeflinの発現を検討している。マウスの実験と同様にこれらの細胞でもMeflinの発現を確認できている。更にこれらの細胞に線維化を誘導し、Meflinの発現量の確認や線維化に関係するマーカーの変化も検討している。
Meflinの機能をより明確にするために、Meflin欠損マウスを作成した。また発現をより明確に確認するために、Meflin発現レポーターマウスを作成することとした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
まずは正常腎あるいは線維化した腎臓におけるMeflinの発現量と局在を検討している。尿管結紮モデル(UUO;Unilateral Ureteral Obstruction）、アデニン腎症などの各種腎線維化モデルを惹起し、経時的に腎組織を採取しReal time PCR法にてMeflinの発現量を、また組織学的にMeflinの局在を検討した。当初は抗Meflin抗体での免疫組織染色を試みたが非特異的な染色が多く十分な解析ができなかった。そこでin situ hybridization法を用いてMeflinのｍRNAの発現を検討した。正常腎でもMeflinは発現するが、各種疾患モデルを惹起するとMeflin陽性細胞の局在が変化し、発現量が上昇することを見出した。Meflinの発現に関する情報はある程度得られたが、より詳細な解析が今後も必要である。
各種腎臓由来の細胞株や初代培養細胞を用いたin vitroの系でもMeflinの発現を検討している。in vivoの系と同様に、腎臓由来の細胞株や初代培養細胞でもMeflinの発現を確認できている。更にこれらの細胞に線維化を誘導し、Meflinの発現量の確認や線維化に関係するマーカーの変化も検討している。
Meflinの機能をより明確にするために、Meflin欠損マウスを作成した。また発現をより明確に確認するために、Meflin発現レポーターマウスを作成することとした。これまでに、Meflin陽性細胞がTomatoで強烈に光るマウスの作成に成功している。
当初に計画していた実験計画通りにほぼ進行しており、本年度はより詳細な病態への関与の解明をすすめ、治療法の開発へとつなげたい。
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| 今後の研究の推進方策 |
まずは引き続き、昨年度野生型のマウスに作成した各種腎疾患モデルの検体を丹念に確認していく。経時的に、もしくは局在的にMeflinの発現と線維化の進展との関連を探索する。
作成したMeflin欠損マウスと野生型マウスにそれぞれ各種腎線維化を来す疾患モデルを惹起し、予後や腎線維化の進行程度を比較検討していく。具体的には昨年度の検討と同様に、in situ hybridization法を用いてMeflinのｍRNAの発現量と局在を検討する。またこれらのマウスの腎臓より組織を採取し、Real time PCR法やWestern blot法を用いてｍRNAや蛋白の発現量を確認する。
その他に、新たに作成したMeflinレポーターマウスを用いて、Meflinの発現と局在をより明らかにしていく。このマウスを用いてより詳細なMeflinの局在が視認できるので、まずはこのマウスの発生に伴う経時的なMeflinの局在の移動を確認する。その後にこのMeflinレポーターマウスに各種腎疾患モデルを惹起して腎線維化を誘導し、Meflinの発現との関連性を探索していく。
Meflin欠損マウスと野生型マウスの腎臓から細胞を分離し細胞株を樹立する。これらの細胞を用いてMeflinの発現や動態を確認した後にMeflinのKnockdownや強制発現を行い、これら細胞の形態的ならびに遺伝子学的な変化を詳細に検討する。
Meflinレポーターマウスの腎臓からも細胞を単離し、これらの細胞の細胞系譜をフローサイトメトリー法（FACS）を用いて確認する。当初の予定通り、多光子励起レーザー走査型顕微鏡下での生体内イメージング法を用い、MSCの動態解析を行う。
ヒトの腎生検組織を用いたMeflinの発現の確認と腎線維化との関係性の検討も進めていく予定である。
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