| 研究課題/領域番号 |
17K09723
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| 研究機関 | 独立行政法人国立病院機構新潟病院(臨床研究部) |
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研究代表者 |
藤中 秀彦 独立行政法人国立病院機構新潟病院(臨床研究部), 臨床研究部, 臨床研究部長 (20447642)
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| 研究分担者 |
矢尾板 永信 新潟大学, 医歯学系, 准教授 (00157950)
山本 格 新潟大学, 医歯学総合研究科, 客員研究員 (30092737)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 尿バイオマーカー / CKD / 蛋白尿 / 腎臓特異的蛋白質 |
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| 研究実績の概要 |
CKDは尿蛋白と腎機能で定義され、通常の検尿のみでは見逃される例が存在する。本研究の目的は、尿蛋白（-）～（±）でもCKDと診断しうる新規尿検査の開発である。従来の尿バイオマーカーの多くは血漿由来蛋白質であり、CKDのごく早期（顕性蛋白尿発症前）の診断には必ずしも有効ではなく、血漿に由来しない（腎臓由来の）微量の尿蛋白質の測定が必要と仮定した。我々が作成した腎臓特異的蛋白質のデータベースの解析から、新しい尿バイオマーカー候補を複数同定できたので、これらを従来の尿バイオマーカーと組み合わせることで早期CKD診断に有効な尿検査を確立したいと考えた。表面プラズモン共鳴(SPR)技術を使用したProteON XPR36システムの使用により、所要1～2日で、約100尿検体につき最大5種の尿バイオマーカーの測定値を同時に得ることが可能である（必要な検体量は100uL程度）。新規尿バイオマーカー候補として糸球体由来、近位尿細管由来、遠位尿細管・集合管由来、腎臓間質由来の尿蛋白質をそれぞれ数個づつリストアップしており、順次測定を開始した。既にIgA腎症成人患者で、いくつかの新規尿バイオマーカー候補蛋白質の尿中排泄増加傾向が確認できている。並行して、従来の尿バイオマーカー（PODXL, B2M, L-FABP, NGAL, KIM-1）のSPRでの測定を行ったが、その結果、我々の新規尿バイオマーカー候補蛋白質とは異なり、蛋白尿陰性(up/uCre<0.15)のIgA腎症尿で高値を取った尿バイオマーカーはなかった。検討した従来の尿バイオマーカーはCKD早期の診断の特異度は高かったが感度は必ずしも高くない可能性が示唆された。CKDの早期診断には、従来の尿バイオマーカーを我々の新規バイオマーカー候補蛋白質と組み合わせることが重要と考えられた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
我々が新規尿バイオマーカー候補蛋白質としたいくつかについて、まず我々が既に所有している、免疫染色可能なモノクロ―ナル抗体を用いて、SPR法での尿中濃度測定を試みたが、多くは測定が不可能であった。当該蛋白質の尿中濃度が測定感度以下であったのか、あるいは尿中に排泄はされているが何らかの理由で測定できないのか不明であった。検討を進めるうちに、安定化剤としてBSAが添加されている抗体はSPR法による尿蛋白質測定が上手くできないことが判明した。また測定する蛋白質の特異性の点から、まずはモノクローナル抗体を使用してきたが、測定感度が低いと思われる場合があり、抗原アフィニティー精製されたポリクロ―ナル抗体による測定も試み、比較検討した。結果として、目的蛋白質の種類にもよるが、ポリクロ―ナル抗体を使用しても測定感度はモノクロ―ナル抗体とあまり違わないことが多いことが分かった。今後はSPR法による測定に使用する抗体の選定が進むため、他のバイオマーカー候補蛋白質についても、測定が加速すると期待される。
新規尿バイオマーカー候補蛋白質のうち、現在まで、糸球体由来1個、間質由来1個の蛋白質の尿中排泄がCKD早期に増加する傾向が確認されているが、確認のためそれぞれ２種類以上の抗体を用いて同様な結果が得られるか検討している。
また従来の尿バイオマーカー（PODXL, B2M, L-FABP, NGAL, KIM-1）との比較検討が進んでおり、これらについてはSPR法による測定値が、市販のELISAキットでの測定値と差異がないか検討が進められている。
上記の検討と並行して尿検体の収集が進み、現在まで小児尿は正常・疾患を含めて約500検体、成人尿も300検体以上が使用可能となっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
尿検体の収集が順調に進んでおり、今後も継続したい。とくに多数の健常小児尿の解析が可能な状態である。健常者尿では、各種腎疾患尿中バイオマーカーは測定感度以下になるのが理想であるが、従来・新規いずれかの尿バイオマーカーで高値を示す健常尿がないかSPR法で、または可能なものはELISAでも検討する。また疾患尿でも蛋白尿がごく軽微な例でバイオマーカーが高値を示すものがないか検討したい。治療を要する尿異常とは言えないもの、例えばナットクラッカー症例や菲薄基底膜病と診断された患者尿の収集も進んでいるので、IgA腎症などのCKD（なかでも蛋白尿がごく軽度な例）と尿中排泄に差異のある尿バイオマーカーを同定したい。また尿アルブミンについてもSPR法により尿中測定が可能であるが、モノクロ―ナル抗体による測定をポリクロ―ナル抗体比較したところ測定感度で劣らず、また特異性はやはりモノクローナル抗体の方が高く、免疫比濁法による測定と差異がないことが分かった。各種尿バイオマーカーをアルブミン低値尿と高値尿に分けて検討するアプローチも可能である。さらに小児と成人との比較（健常者で差があるか、IgA腎症で小児と成人で差があるか）、成人では疾患による差の検討（IgA腎症と糖尿病性腎症とで差があるか）も進めていく。
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