| 研究課題/領域番号 |
17K09758
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| 研究機関 | 佐賀大学 |
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研究代表者 |
原 英夫 佐賀大学, 医学部, 教授 (00260381)
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| 研究分担者 |
中山 功一 佐賀大学, 医学部, 教授 (50420609)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 脳アミロイド血管症 / バイオ3D プリンター / スフェロイド / Aβ40/42 / アミロイド前駆蛋白遺伝子 |
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| 研究実績の概要 |
脳アミロイド血管症は血管壁に主としてAβ40が蓄積し血管壁が脆弱となり、正常血圧でも血管が破綻し、しばしば大脳皮質下の大出血を起こす疾患である。これまで多くのアルツハイマー型認知症の動物モデルであるトランスジェニックマウスが作成されてきたが、脳アミロイド血管症は再現されておらず病態機序解明や治療法開発に苦渋している。我々のグループは従来の再生医療/ティッシューエンジニアリングの手法とは全く異なるアプローチで、細胞凝集塊を積み上げることにより、任意のXYZ の位置に複数の細胞を配置することにも成功し、細胞だけで任意の形状の細胞構造体を作る手法(Bio Rapid prototyping system;以下BRP)を確立した。またロボットシステムにより、細胞だけで立体的な構造体を作成するいわゆるバイオ3D プリンターの開発に成功し、線維芽細胞と内皮細胞、平滑筋細胞の組み合わせで、他所にはみられない弾力性を持ったチューブ状の細胞構造体を作成することに成功した。今回、この基盤を応用し細胞のみで構成した小口径Scaffold free 細胞チューブを用いて脳アミロイド血管症のモデルを作成し、その病態生理を解明することを目的として研究している。今年度は、Bio Rapid prototyping systemとバイオ3D プリンターを用いて、脳アミロイド血管症のモデル血管をin vitroにおいて作成を試みた。ヒト線維芽細胞（NHDF 40%)/平滑筋細胞（SMC 60%）/ヒト臍帯静脈内皮細胞（Huvec 10%）のコンストラクトを作り細胞にAβが付着する進行度を調べた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
我々は細胞凝集塊を積み上げることにより、任意のXYZ の位置に複数の細胞を配置することにも成功し、細胞だけで任意の形状の細胞構造体を作る手法を確立した。接着系細胞が有する基本的機能である細胞凝集現象により、細胞を低接着性のwellに置いておくだけで細胞同士が融合し球体（細胞凝集塊、スフェロイド）が形成される。ヒト線維芽細胞（Normal Human Dermal Fibroblast；NHDF）と平滑筋細胞(Smooth Muscle Cell ;SMC)およびヒト臍帯静脈内皮細胞(human umbilical vein endothelial cell; Huvec)を用いてスフェロイドを作りAβが細胞に付着するか実験を行った。NHDF(40%)/SMC(60%)/ Huvec 10%の比率でスフェロイドを剣山に挿入し細胞を融合させ管腔構造を持つコンストラクトのチューブ型を作りAβが細胞に付着するか実験を行った。Aβ40ペプチドを含む培養液に入れ4週間培養し血管の平滑筋構造の中に付着したAβを蛍光免疫染色で確認した。一方、神経芽細胞株SHSY-5Yにアミロイド前駆蛋白遺伝子(APP)を安定発現させた細胞株を作成した(SHSY-APP)。この細胞株の培養上清中にはAβ40は600.6pg/ml, Aβ42は46.4pg/mlの濃度で含まれている。管腔構造のチューブをSHSY-APPの培養上清の中で２～４週間培養し、血管の平滑筋構造の中に付着したAβを蛍光免疫染色で確認した。コラーゲン4免疫染色とAβ免疫染色の二重蛍光染色では、細胞外マトリックスに存在するコラーゲン蛋白にAβ蛋白が沈着している事が判明した。
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| 今後の研究の推進方策 |
現在、血管を構成している3種類の細胞、NHDF/SMC/Huvecを用いてスフェロイド形成後、3Dプリンターを用いて積層を行い血管を作成した。また各種濃度のAβ40を含む培養液を加えた結果、平滑筋構造の中のコラーゲン蛋白にAβ蛋白が付着していた。今後はコントロールの血管とAβ40ペプチドを加えた血管の力学的強度、生理学的機能、分子生物学的機能を解析する。次に脳アミロイド血管症のモデルとコントロール血管の組織学的病理学的解析を行う。Aβ40ペプチドの血管壁の沈着部位、その周囲の内皮細胞や平滑筋、アストロサイトの足突起の形態を詳細に解析する。さらに脳血液関門の生理学的機能についても両者で比較する。例えば物質透過性、ICAM-1など種々の接着分子の発現状態などを免疫組織学的にも検索する。血管培養中に内皮から分泌される炎症性サイトカイン(IL-1, IL-12, TNF-α, IFN-γなど)はELISA法で測定する。ApoE４はアルツハイマー病の遺伝的危険因子であることが証明されており、脳から血管を介してAβが排出されるメカニズムとしてApoE４蛋白の関与が想定されている。In vivoの実験でアミロイド血管症のモデル血管にApoE４蛋白（コントロールとしてApoE２蛋白）を加える事により、血管壁から血管腔内へAβ蛋白が移動する動態を解析し排出されるメカニズムを解明する。さらに実験動物への血管の移植実験を行いin vivoでの脳アミロイド血管症のモデルを解析する予定である。
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