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2017 年度 実施状況報告書

GDP型Rab27a変換機構の解明とインスリン分泌後のエンドサイトーシス

研究課題

研究課題/領域番号 17K09838
研究機関大分大学

研究代表者

木村 俊秀  大分大学, 医学部, 准教授 (60404373)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2020-03-31
キーワード糖尿病 / インスリン / 膵B細胞 / シグナル伝達 / プロテオーム / タンパク質 / 低分子量Gタンパク質 / Rab27a
研究実績の概要

本研究ではRab27aをGDP型に変換するEPI64に着目し、その新たな結合パートナーであるGαの結合特性や役割を解析することでエンドサイトーシスの開始シグナルの解明を目指す。エンドサイトーシスは、インスリン分泌の量とタイミングを決めるために必須であり、その破綻は2型糖尿病の新たな原因となりうる。しかし、これまでの研究ではインスリンを放出するまでの過程を扱い、その後のステップを扱った研究は皆無である。本研究は、申請者が同定したGDP型Rab27aシグナルを解析することで、開口放出後のエンドサイトーシスシグナルの解明を行う。
本年度は、EPI64とGαの結合を生化学的に解析した。まず、Gαの特異的抗体とリコンビナントタンパク質を作製した。次に、免疫沈降実験と精製タンパク質を用いた結合実験より、GαとEPI64が細胞内で複合体を形成すること、その結合が直接で特異的であることを明らかにした。次に、EPI64のフラグメントを作製し、Gα結合ドメインを同定した。さらに、同定した結合部位をもとにドミナントネガティブ/アクティブ変異体の作製を行った。また、マウス膵切片を免疫染色し、EPI64とGαが膵B細胞で共発現していることを明らかにした。
以上の結果より、EPI64とGαの結合様式が明らかになった。本研究成果は、次年度以降に行うGαによるEPI64の活性制御機構を理解する上で極めて重要であると共に、GDP型Gタンパク質によるシグナリングという意味からも基礎生物学上重要な知見である。従って、本年度の研究計画は、当初の計画以上に進展していると考えている。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

1: 当初の計画以上に進展している

理由

本研究では、EPI64とその結合タンパク質であるGαが、インスリン顆粒膜のエンドサイトーシスを制御する分子メカニズムを、以下に従って解明する予定である。
平成29年度:EPI64とGαの結合様式を解析する。
平成30年度:GαによるEPI64の活性制御機構を解析する。
平成31年度:Gαの上流シグナルを解析する。
本年度は、EPI64とGαの結合様式を生化学的な手法により明らかにした。従って、本年度の研究計画は、当初の計画以上に進展していると考えている。

今後の研究の推進方策

平成30年度は、前年度の成果を基盤にGαによるEPI64の活性制御機構を検討する。
1. Gαには、2つのシグナル経路が備わっている。GTP型に変換されたGαと、Gαの変換によって解離し活性を示すGβγである。そこで、どちらの分子がEPI64の活性を制御しているのかを調べる。
2. 申請者は、Gαの発現を抑制した細胞では、EPI64の活性化に必要なPIP3が産生されないことを既に見出している。そこで、グルコースによるエンドサイトーシスに関与するPI3キナーゼの同定を試みる。
3. PI3キナーゼの細胞内動態を共焦点レーザー顕微鏡と全反射蛍光顕微鏡で解析する。さらに、Gαのノックダウンや過剰発現、Gβγ阻害剤がPI3キナーゼの細胞内動態に及ぼす影響を検討する。

次年度使用額が生じた理由

Gαのリコンビナントタンパク質は、当初想定していたバキュロウイルスを用いた昆虫細胞からではなく、大腸菌より精製した。そのため、次年度使用額が生じた。当該研究費は、翌年度以降の研究費と共に、Gαの各種変異体の作製にあてる予定である。平成30年度は、前年度の成果を基盤にGαによるEPI64の活性制御機構を検討する。

  • 研究成果

    (4件)

すべて 2017

すべて 学会発表 (3件) (うち招待講演 1件) 図書 (1件)

  • [学会発表] 膵B細胞におけるグルコース誘導性エンドサイトーシスの分子メカニズムの解析2017

    • 著者名/発表者名
      山岡真美、荒巻千香子、姫野冴美、寺林健、石崎敏理、木村俊秀
    • 学会等名
      第60回 日本糖尿病学会年次学術集会
  • [学会発表] Endocytosis after insulin secretion2017

    • 著者名/発表者名
      木村俊秀
    • 学会等名
      第60回 日本糖尿病学会年次学術集会
    • 招待講演
  • [学会発表] 膵B細胞におけるグルコース誘導性エンドサイトーシスの解析2017

    • 著者名/発表者名
      山岡真美、寺林健、石崎敏理、木村俊秀
    • 学会等名
      第40回 日本分子生物学会年会
  • [図書] Diabetes Strategy2017

    • 著者名/発表者名
      山岡真美
    • 総ページ数
      6
    • 出版者
      株式会社 先端医学社

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公開日: 2018-12-17  

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