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本研究ではRab27aをGDP型に変換するEPI64に着目し、その新たな結合パートナーであるGαの結合特性や役割を解析することでエンドサイトーシスの開始シグナルの解明を目指す。エンドサイトーシスは、インスリン分泌の量とタイミングを決めるために必須であり、その破綻は2型糖尿病の新たな原因となりうる。しかし、これまでの研究ではインスリンを放出するまでの過程を扱い、その後のステップを扱った研究は皆無である。本研究は、申請者が同定したGDP型Rab27aシグナルを解析することで、開口放出後のエンドサイトーシスシグナルの解明を行う。
本年度は、Gαの上流シグナルの解析を行った。まず、GαのGST融合タンパク質を大量培養し、精製した。次に、GST-Gαをリガンドとしたアフィニティカラムクロマトグラフィを行った。具体的には、培養膵B細胞であるMIN6の抽出液をGST-Gαカラムにアプライし、洗浄後に結合タンパク質を塩で溶出した。次に、溶出画分をSDS-PAGEで分離した後に銀染色を行い、Gαに特異的に結合するタンパク質の候補を複数選別した。最後に、ゲルからタンパク質を抽出し、LC-MS/MSによりGα結合タンパク質を同定した。
以上の結果より、Gαの上流シグナルの概要が明らかになった。本研究成果は、GDP型Gタンパク質によるシグナリングという意味からも基礎生物学上重要な知見である。従って、本年度の研究計画は、当初の計画以上に進展していると考えている。
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