研究課題
【動脈硬化病変局所におけるSkp2-p27kip経路および細胞周期の評価】動脈硬化モデルマウス(Apo E KOマウス)にhigh fat dietを行い動脈硬化症モデルマウスとして血管病変局所でのp27kipおよびSkp2の発現評価をするために、大動脈弁輪部の連続切片を用いてMφの表面抗原マーカー(CD11b)と細胞周期進行のマーカー(PCNA)・p27kip抗体・Skp2抗体で多重免疫染色を行ったところ動脈硬化弁輪部で増殖Mφに一致したSkp2の発現を認めた。AMPK活性化剤AICARおよびアデノウイルスベクターを用いて恒常活性型constitutively active mutant(T172D) -AMPKα(CA-AMPK)、優位抑制型dominant negative mutant(T172A)-AMPKα(DN-AMPK)を過剰発現することでAMPK活性制御を行い、増殖抑制状態のマウス腹腔マクロファージを用いて、細胞増殖の評価を、[3H]チミジン取り込み法、細胞数算定法を用いて行った。増殖誘導刺激(Ox-LDL、GM-CSF)により有意に細胞増殖が誘導された。細胞周期の評価を、Propidium iodideを用いたFlow cytometry法で行った。増殖誘導刺激(Ox-LDL、GM-CSF)により優位に細胞周期G2/M期の細胞が増加していた。増殖刺激で増加したSkp2の発現はAMPK活性誘導により部分的に抑制された。p27kipは元々の発現が弱く増殖刺激での変化は観察されなかったがAMPK活性誘導によりその発現が増加した。またSkp2によるp27kipのユビキチン化とマクロファージ増殖能との関連を解明するためp27kip抗体で免疫沈降を行い、ユビキチン抗体でユビキチン化を定量化した。増殖抑制状態のマクロファージではp27kipのユビキチン化が増加した。
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