| 研究課題/領域番号 |
17K09867
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| 研究機関 | 杏林大学 |
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研究代表者 |
後藤田 貴也 杏林大学, 医学部, 教授 (60322062)
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| 研究分担者 |
山本 隆史 杏林大学, 医学部, 助教 (00572033)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | メタボリックシンドローム / トランスポーター / ビリルビン / 脂肪蓄積 / 遺伝子 |
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| 研究実績の概要 |
①ビリルビンのin vitroにおける取込み実験系の構築と評価
Slc22a18のノックアウト(KO)マウスの解析によりビリルビンをSlc22a18の有力な基質候補と考え、取込み実験系の構築と評価を行った。ビリルビンと特異的に結合し蛍光を発する蛋白(UnaG)がすでに報告されている。そこで、細胞内のUnaG-ビリルビン複合体の蛍光強度の測定によりin vitroにおけるビリルビン取込みの間接的な評価が可能と考えられた。まず、UnaG発現アデノウィルスをH2.35細胞に発現させ、その細胞溶解液の蛍光強度が培地添加ビリルビン依存的に増加することを確認した。次に、doxcycline誘導性のSlc22a18発現アデノウィルスを作製しH2.35細胞にUnaGと共発現させたところ、生理的な濃度のビリルビン存在下でSlc22a18発現群では蛍光強度が増加することを確認した。またH2.35細胞においてSlc22a18発現誘導の有無下でUnaG発現量の変動をウェスタンブロットで評価した結果、Slc22a18発現の誘導はUnaGタンパク量には影響を与えないことが確認された。以上の結果より、間接的ではあるが、Slc22a18がin vitroにおいて細胞内へのビリルビンの取り込みを増加させることが示唆された。
②ビリルビン以外のSlc22a18の生理的内因性基質の探索
SLCトランスポーターはイオン性物質を基質とすることが多いため、その網羅的検出に優れるCE-TOFMS法によるメタボローム解析を行った。普通食で飼育した9週齢のオスの野生型マウスとSlc22a18KOマウス、および一過性のSlc22a18発現誘導モデルマウスと発現抑制モデルマウスの計4群のマウスの肝臓について解析を行ったところ、89物質（陽イオン物質50、陰イオン物質39）が同定され、ビリルビン以外の基質候補分子の探索中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
現在までに、ビリルビンを用いた取込み実験系を作製し、Slc22a18の強発現が細胞内ビリルビン濃度に与える影響を間接的に評価することはできた。この間接的評価系の構築に予想以上の時間を要したため、一過性にSlc22a18を発現誘導もしくは発現抑制したモデルマウスでのビリルビン測定による直接的評価実験についてはまだ準備中であり、次年度以降に行う予定である。またCE-TOFMS法によるメタボローム解析結果をもとにしたビリルビン以外の基質候補の探索も並行して継続予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
UnaGを用いた実験結果より、Slc22a18の発現が細胞内ビリルビン濃度を増加させる可能性が強く示唆された。そこでより直接的にビリルビン濃度の増加を測定するため、生化学的な血中ビリルビン濃度測定用キットを用いた検出を試みる。従来の方法ではわれわれの実験系では検出限界以下となるが、出発材料を増やし抽出したビリルビンを濃縮する等の工夫により測定できる可能性がある。またメタボローム解析の結果から、ビリルビン以外の基質候補になりうる化合物を見出せれば、ビリルビンとは独立にSlc22a18との関連を調べる予定である。
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